材料和试剂

玻璃底盘（35毫米）和＃1S厚度的盖玻片（IWAKI，目录号：3971-035）
鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞（ATCC ，目录号：CLC-131）
质粒载体为绿色荧光蛋白（GFP） -标记的wildype Optineurin（GFP-OPTN-WT）在哺乳动物细胞（表达pGFP -OPTN-WT ）（RIKEN DNA银行人力资源，目录号：RDB16707）（北村等人，2018 ）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM ）（Sigma-Aldrich公司，CA talog号：D5796）
胎牛血清（FBS ）（Thermo Fisher ，目录号：12676029 ）
青霉素-链霉素溶液（× 100）（Fujifilm Wako Pure Chemicals，目录号：168-23191 ）
Opti-MEM I降低血清培养基（Thermo Fisher ，目录号：31985070 ）

设备

带有C- Aprochromat 40×/ 1.2 W UV-VIS-IR水浸物镜的激光扫描显微镜（LSM）510 META （Carl Zeiss）
GNU Octave或MATLAB（MathWorks，Natick，MA）用于计算空间自相关函数（SACF）图像
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）

软件

斐济或ImageJ软件进行图像处理
三维非线性曲线拟合软件
在这里，我们介绍使用Origin（OriginLab。Corp .，Northampton，MA）的过程；但是，您可以使用其他软件进行非线性3D曲线拟合（例如，表格曲线3D或LAB拟合）。

程序

图1. 使用ICS从荧光图像确定尺寸的方案。一。表达GFP-OPTN-WT的单个Neuro-2a细胞的荧光图像（绿色）。乙。扣除背景强度后的荧光图像。Ç 。从表达GFP-OPTN-WT的细胞计算得到的ACF。伪彩色标度显示在图像的底部。d 。图像从ACF裁剪出中心区域。白条= 2 μ米。黑条＝ 550nm。

细胞准备
笔记：

细胞应在覆盖玻璃上生长，其厚度应与物镜的特性相匹配。例如，厚度为0.17 mm的盖玻片（通常称为＃1.5或＃1S厚度；例如，圆形微盖玻璃＃CS01804，Matsunami ）对于显微物镜是最流行的。当使用带有校正环的物镜（例如C-Apochromat 40 ×/ 1.2NA W Korr）时，有必要将校正环调整为适当的盖玻片厚度。UV-VIS-IR（卡尔·蔡司）。IWAKI Cat＃3971-035等玻璃底盘可用于活细胞。
可以使用任何种类的荧光标记程序（例如，使用荧光蛋白，免疫荧光或DNA-PAINT）。
当亚细胞结构在图像采集过程中可移动时，需要使用甲醛或有机溶剂进行细胞固定。
最好使用荧光蛋白，因为如果抗体不染色紧密组装的聚集体（如聚谷氨酰胺IBs）的中心核心区域，其大小可能会被ICS低估。
尽管可以使用所有类型的荧光显微镜，但像素尺寸应小于光学横向分辨率的一半。通常，对于蓝色激发光，要求小于100 nm /像素，因为光学横向分辨率大约是波长的一半。共焦显微镜易于实现，因为它具有数字变焦功能。

在转染前1天，将Neuro-2a细胞（2.0 x 10 5个细胞）铺在玻璃底盘中。培养培养基是补充有10％FBS和1 x 青霉素-链霉素的DMEM （常规培养培养基）。
质粒DNA（1.0 μ 克的PGF P -OPTN-WT）转染入用2.5细胞μ 升的Lipofectamine 2000在Opti-MEM培养基。
孵育1晚后，在改变介质进入正常cultureing 介质上，然后，荧光图像是使用CONF获取OCAL荧光显微镜。

图像采集
采集共聚焦荧光图像。通常，对于Neuro-2a细胞中GFP-OPTN的亚细胞结构（Kitamura 等人，2018）：针孔通风单位为1; X和Y扫描尺寸分别为512像素（这些尺寸必须是2的幂）；缩放系数为8（像素大小为55 nm）；平均线为4；像素停留时间为6.39 μ 小号。为避免饱和荧光强度，请更改查找表（LUT：HiLo 或范围指示器），并在使用伪彩色观察强度的同时调整检测器增益。
将图像另存为LSM / CZI文件（否则，请使用具有原始强度的格式，例如非压缩TIFF）。

背景强度减法
在斐济打开图像。
使用“椭圆工具”在细胞外区域绘制感兴趣的圆形区域（ROI）。ROI大小是任意的。注意不要包含任何荧光阳性结构，例如灰尘。
测量使用“测量”工具的荧光强度（分析- >测量;否则，Ctrl + M键中KEYB OARD 作为快捷方式），其为背景强度。
打开“减法”工具（过程->数学->减法）。
在“值”窗口中输入背景强度。然后单击“确定”。
将图像保存为未压缩的TIFF（的“ example.tif ”作为文件名的例子在这里和下面）。

空间自相关函数（SACF）图像的计算
在使用Octave / MATLAB进行处理之前，将路径添加到“ example.tif ”所在的文件夹中，或者将该文件移至可以执行Octave命令的操作文件夹中。
ø 笔“ example.tif ”和负载荧光强度信息到存储器中，定义待存储的存储器的名称。您可以使用任何名称作为内存。在此，例如使用“ IMG”（命令＃1）。
对图像执行傅立叶变换，然后将结果加载到另一个存储器中（命令2）。
由于它是傅立叶空间中的复数，因此仅将实数部分加载到另一个存储器中（命令3）。
通过对傅立叶变换图像的实部进行平方运算，将功率谱计算并加载到另一个存储器（PS）中（命令4）。
使用最大功率对功率谱进行归一化，并将结果加载到存储器中（命令5）。
通过归一化功率谱的傅立叶逆变换来计算空间ACF（命令6）。
用最大值对获得的自相关函数进行归一化（命令7）。
使用最小值对获得的自相关函数进行归一化（命令8）。
执行命令以将图像的中心转换为坐标轴的原点，并创建完整的空间ACF图像（命令＃9）。
显示并确认计算出的空间ACF图像（命令10）。
节省空间ACF图像作为TIFF图像文件（例如，exampleACF.tif ）（命令＃11）。
如果删除了所用内存中的所有日志，请执行命令＃12。

笔记：

通过并行编写命令，可以对上述所有操作进行批处理。
所有命令均与MATLAB兼容。不需要其他工具箱。

程序命令：

IMG =未读（' example.tif '）;
FIMG = fft2（IMG）;
RFIMG = abs（FIMG）;
PS = RFIMG。^ 2;
NPS = PS。/ max（PS（:)）;
ACF = ifft2（NPS）;
ACFM = ACF./ max（ACF（:)）;
NACF =（ACFM-min（ACFM（：）））./（1-min（ACFM（:)）））;
SACF = fftshift （NACF）;
imshow （SACF）；
imwrite （SACF， ' exampleACF.tif '）;
清除。

SACF中心峰的曲线拟合分析
在斐济打开空间自相关函数（exampleACF.tif ）。
[可选]将LUT更改为一个使其更容易区分诸如“ Fire”之类的峰的位置。
绘制一个方形ROI，其中包括SACF中心的峰分布。
制作所选ROI的副本图像['Image'->'Duplicate']。
将图像另存为文本图像['文件'->'另存为'->'文本图像']。
使用“导入向导”在Origin中打开保存的文本图像。
将A列的属性从X轴更改为Y轴。
通过选择3D三元颜色图曲面来忽略X轴值。
打开用于非线性曲面拟合的向导。
选择“ Gaussian2D”拟合函数，然后执行拟合。
拟合的参数应导出。的瓦特1 和瓦特2 是用于X轴和Y轴的高斯分布的标准偏差，分别。这些是指示大小的参数。该THETA 是朝向修正参数。如果SACF分布相对于XY平面旋转，则此参数指示旋转方向。
[可选]如果您没有OriginPro 的许可证或包含非线性曲面拟合程序的基于GUI的适当软件，则可以使用数值计算程序（例如MATLAB，Octave，Python和R）来构建程序。

包含已知半径的点的图像准备
创建一个新的图像，其大小为2 ，048 X 2 ，048和填充（白色斐济文件- >新建- >图像;类型：8位;与填充：;宽白：2 ，048;身高：2 ，048；切片：1）。
使用ROI管理器为大小已知的点创建ROI，并指定ROI工具（分析->工具-> ROI 管理器->更多->指定… ；然后在“宽度”和“高度”中输入已知大小； X-和Y坐标为1024；选中“椭圆”和“居中”；然后单击“确定”。
填充ROI（编辑->填充）。
将图像另存为TIFF。
计算包含尺寸已知点的图像的空间自相关函数。

[附加信息]为了获得作为荧光强度减半而不是高斯分布的标准偏差的半径的集合大小，可以通过计算包括已知点的图像的ACF来获得两者之间的转换公式。半径如上。还请参阅我们的解原纸的尾部（图URE 2C 和2 d在北村等人，2018）。此外，大小已知的点计算为在由ICS相同的大小（图URE 在北村2E 等人，2018）。

致谢

我们感谢清水裕树先生。AK得到了日本科学促进会（JSPS）的资助，以促进联合国际研究（促进联合国际研究）的资助（16KK0156）；由科学研究资助计划（C）（18K06201）；佳能基金会的资助（2018-2019）; 由日本科学技术协会（JST）通过目标驱动的研发（A-STEP）进行的代理机构适应性和无缝技术转移计划援助（VP30318089120）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

参考文献

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Kitamura，A.和Kinjo，M.（2018）。基于最新荧光波动的光谱技术，用于蛋白质聚集的研究。国际分子科学19（4）。
Kitamura，A.，Nagata，K.和Kinjo，M.（2015）。通过FRET和活细胞成像技术对错误折叠的蛋白质聚集进行构象分析。国际分子科学杂志16（3）：6076-6092。
Kitamura，A.，Shimizu，H.和Kinjo，M.（2018）。使用图像相关光谱法确定细胞质中的optineurin病灶大小。Ĵ 生物化学164（3）：223-229。
Kolin ，DL和Wiseman，PW（2007）。图像相关光谱学的进展：测量细胞中荧光标记的大分子的密度，聚集状态和动力学。Cell Biochem Biophys 49（3）：141-164。
Oasa ，S.，Sasaki，A.，Yamamoto，J.，Mikuni，S.和Kinjo，M.（2015）。使用荧光相关光谱法和微孔研究了单细胞糖皮质激素受体的同质化。FEBS Lett 589（17）：2171-2178。
罗斯（Ross，CA）和波里耶（Poirier），马萨诸塞州（2004）。蛋白质聚集和神经退行性疾病。Nat Med 10增刊：S10-17。
Veerapathiran ，S.和Wohland ，T.（2018）。发育生物学中的荧光技术。Ĵ BIOSCI 43（3）：541-553。