材料和试剂

6孔和12孔组织培养板
10厘米组织培养皿
T-75组织培养瓶
0.22 亩米过滤FLAS KS [ A，使得在作为MilliporeSigma TM Stericup TM 快速释放-HV VACUU 米过滤系统（0.45孔径）] （˚F Isher，目录号的：SCHVU02RE）
0.22 亩中号滤波器（一个此类的如MilliporeSigma TM 的Millex TM -GP无菌SY 林格过滤器与PES膜）（费希尔，目录号的：SLGP033RS）
Steriflip 50 ml锥形管（MilliporeSigma TM Steriflip TM 无菌一次性真空过滤器）（Fisher，目录号：SCGP00525）
50 ml锥形管
过滤器/屏障和非过滤器/屏障提示
血清移液器
293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216），在完整DMEM中的g 行：DMEM 10％FBS，1％Pen / Strep
-1细胞THP（NIH AIDS试剂方案，目录号的：9942; RRID，目录号的：CVCL_0006），克在完全RPMI行：RPMI 10％FBS，1％Pe的N /链霉素，10 毫HEPES，Glutamax的
TZM-bl 细胞（NIH AIDS试剂程序，目录号：8129），完整DMEM中的g 行：DMEM 10％FBS，1％Pen / Strep
HIV-CRISPR质粒（NIH AIDS试剂程序，目录号：13567）
HIV-CRISPR库（PIKA-HIV库，NIH AIDS试剂程序，目录号：13566）
HIV载体包装和包膜质粒：pMD2.G质粒（Addgene ，目录号：12259）和psPAX2质粒（Addgene ，目录号：12260）
胎牛血清，热灭活的（峰值血清，目录号：PS-FB2或同等产品）
DMEM（Gibco，目录号：11965-092）
RPMI（Gibco，目录号：11875-093）
青霉素/链霉素（Gibco，目录号：15140-122或同等产品）
HEPES（Gibco，目录号：15630-080）
Glutamax （Gibco ，目录号：35050-061）
Mirus Bio Trans IT-LT1转染试剂（Fisher Scientific，目录号：MIR2305）
牛血清白蛋白（Sigma，目录号：A1933）
盐酸嘌呤霉素（Sigma，目录号：P8833）
HIV病毒库，例如HIV LAI （BRU）病毒库（NIH AIDS试剂计划，目录号：2522）
DEAE-右旋糖酐盐酸盐（Sigma，目录号：D9885）
Qubit dsDNA HS检测试剂盒（Thermo Fisher，目录号：Q32854）
QIAamp 病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen，目录号：52904）
QIAamp DNA Blood Midi Kit（Qiagen，目录号：51185）
QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，目录号：28104）
RNAse AWAY去污试剂（Thermo Fisher，目录号：10328011）
SuperScript II逆转录酶（Thermo Fisher，目录号：18064014）
Herculase II融合DNA聚合酶（安捷伦，目录号：600679）
PCR寡核苷酸（请参阅补充资料）
用于PCR1反应的寡核苷酸是IDT定制的DNA寡核苷酸，具有标准的纯化/脱盐功能（或等效方法）.PCR2反应寡核苷酸（R2_R，R2_Indexes）是来自IDT的HPLC纯化的超聚物（或等效方法）。

dNTP（Thermo Fisher，货号：R0192）
DMSO（Sigma，目录号：472301）
无核酸酶H 2 O
琼脂糖
Agencourt AMPure XP Beads（贝克曼库尔特生命科学，目录号：A63880）
HiSeq Rapid SBS Kit v2（Illumina，目录号：FC-402-4022）
HiSeq Rapid Cluster Kit v2（Illumina，目录号：GF-402-4002）
MiSeq 试剂盒v2（Illumina，目录号：MS-102-2001）
PhiX Control V3套件（Illumina，目录号：FC-110-3001）
Tris base（Sigma，目录号：10708976001）
硼酸（Sigma，目录号：B6768）
0.5 M EDTA（Sigma，目录号：E9884）
10x TBE运行缓冲区（请参阅配方）

可选的：

人IFN Alpha杂种（通用I型干扰素）（PBL分析科学，目录号：11200-1）。在0.1％BSA的PBS中稀释，并将等分试样保持在-80°C
蔗糖
氯化钠
20％蔗糖溶液（请参见食谱）。

配套设备

SW28 Beckman聚异戊二烯超速离心管（Beckman Coulter，目录号：326823）
中号Icrocentrifuge（的Eppendorf，型号：5425R 或者等效）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-90K 或同等产品）
SW28（Eppendorf，目录号：342207）或SW32Ti（Beckman Coulter，目录号：369694）超速离心转子（或等效装置）
Eppendorf 5810台式离心机（Eppendorf，目录号：022625004）
摆动斗式转子（Rotor S-4-104 ）（Eppendorf，目录号：5820755008）
摆桶式转子板转接件（Eppendorf，目录号：022638866）
涡流
水浴
纳米滴
Applied Biosystems ProFlex 热循环仪（或等效产品）
磁力架（96孔）
Qubit 4荧光计（Thermo Fisher）
Illumina MiSeq ，HiSeq 或同等学历
CO 2 组织培养培养箱
- 80℃的冰箱中

软体类

MAGECK：https：//sourceforge.net/p/mageck/wiki/Home/
领结：http : //bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
FASTX Toolkit条形码分割器：http ://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/

程序

的再修改的概述ë （图1）：

HIV-CRISPR库慢病毒载体的制备（A）
HIV-CRISPR慢病毒载体股票滴度的定量（B）
HIV-CRISPR文库转导（C）
HIV-CRISPR文库细胞感染（D）
HIV-CRISPR细胞基因组DNA提取（E）
HIV-CRISPR病毒RNA提取（F）
细胞基因组DNA HIV-CRISPR文库扩增（G）
病毒RNA HIV-CRISPR文库扩增（H）
磁带库清理：双面SPRI （I）
图书馆量化（J）
高通量测序（K）的库
HIV-CRISPR库（L）的高通量测序（HTS ）
HIV-CRISPR 筛选分析（M）

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902432--1364莫莉·奥海尔735131 \图jpg \图1.jpg

图1.总体HIV-CRISPR筛选程序示意图

HIV-CRISP R库慢病毒载体的制备
程序A 的目标是生成库规模的HIV-CRISPR慢病毒载体原种，用于创建HIV-CRISPR细胞（程序C）。

第0天：铺板293T细胞
转染前一天，将293T细胞以2 x 10 5 细胞/ ml的浓度在6孔板中以2 ml /孔的浓度接种。使用维持在汇合以下的低传代293T细胞数次传代，以提高慢病毒滴度。 6孔20个板准备的时间和通常就足够了几个转导的〜15000因组库或者一个转导A〜100000因组全- 基因组文库。

第一天：转染
检查细胞的融合度：理想情况下，转染时细胞应达到50％融合度。
对于6孔板的每个孔，将667 ng的HIV-CRISPR文库质粒，500 ng的psPAX2质粒（HIV GagPol ）和333 ng的pMD2.G质粒（VSV-G）混合。
将所有DNA加入200μl 无血清培养基（SFM-DMEM）中并涡旋5秒钟。
将TransIT-LT1转染试剂置于室温并涡旋5秒钟，确保看不到沉淀物。
4.5添加Myueru 的TransIT-LT1（比率中3 Myueru MIRUS向1- Myug 中总质粒DNA）直接连接到SFM媒体/ DNA，涡旋10 S.
将DNA / TransIT-LT1混合物孵育20分钟以形成复合物。
将转染混合物缓慢添加到293T细胞的每个孔中，并轻轻旋转平板以分布。
第2天：更换转染培养基
取出培养基，每孔用1.5 ml完整DMEM替换。

第三天：收集病毒上清液
从细胞中去除病毒克隆。
可选：每孔用1.5 ml完整DMEM替换培养基，第二天进行第二次收集。

上清液通过离心澄清细胞碎片5分钟。在1 ，000 ×g下在室温下。
注：一个的L1离心步骤进行，在室温（23 ℃），除非另有说明。

在新的50 ml F alcon管中收集清除的病毒克隆。
（可选）第4天：收集病毒上清液，硅Milarly作为在第3天池上清液从类别1和2一起。
过滤：过滤病毒上清用0.22 MYU 中号过滤瓶。
注意：上清液可以在4°C下过夜或几天保存，而不会显着降低感染力。

维鲁S浓度：..加入病毒上清SW28贝克曼异质同超速离心管中如果小于33毫升病毒上清33毫升是可用的，充满DMEM媒体小心加20 Pasento蔗糖溶液到每个SW28贝克曼异质同超速管式带4毫升5 ml移液器。试管应从顶部开始加满0.5 cm，以免在超速离心过程中塌陷。根据需要用完整的DMEM培养基填充试管。
在超速离心机SW28管加载到预冷冻SW28或者SW32Ti转子。自旋在70000 ×g离心1小时。在4℃下。
倾析澄清的病毒印迹，然后将试管在纸巾上倒置干燥几分钟，然后将每个试管放入50 ml锥形管中，以所需的体积（200μl 至1 ml）重悬（不可见的）沉淀，然后在室温下孵育4℃。
孵育15-60分钟后，轻轻涡旋5秒钟，在4°C孵育数小时（或理想情况下过夜），偶尔涡旋。
使用1 ml移液器将病毒沉淀轻轻重悬于DMEM培养基中（避免产生气泡），合并所有气泡，混合，等分并冷冻至-°C 80。小等分试样（20-50 MYU 大号）可制成对于滴定在TZM- B1中或其它细胞。
ñ OTES：

根据所需的慢病毒载体数量，按需扩大转染规模。
在6孔板中比10 cm或其他培养皿中，慢病毒载体的生产效率更高。
所有废物均应根据机构生物安全规则进行处理。

HIV-CRISPR慢病毒载体股票滴度的定量
此步骤的目的是量化程序A中产生的慢病毒载体原液的滴度。此处使用的菌落形成分析将允许计算实现所需感染复数（MOI）所需的慢病毒载体原液的体积。（MOI）是感染性颗粒与细胞数量的比率，可用于平均向培养中的细胞递送特定数量的转导慢病毒载体。

第0天：细胞铺板
将TZM-b1细胞以1.5 x 10 5个细胞/ ml的量接种在12孔板中（每孔1 ml）。

第一天：病毒感染
媒体替换为300 Myueru 完全DMEM，用终浓度为20 MYU 摹/毫升DEAE葡聚糖。
解冻HIV-CRISPR慢病毒制剂的等分试样。
下面HIV准备-CRISPR慢病毒稀释液一式两份在完全DMEM：1：10,1：100,1：1000，1：3000，1：10,000（例如，稀20 MYU 大号至180 MYU 大号为1:10稀释，从那里连续稀释）
20添加MYU 大号稀释慢病毒载体每口井的12孔板一式两份。
使用台式离心机和转桶式转子/板适配器，通过在室温下以1100 xg 的转速自旋感染（旋转接种）30分钟来感染细胞。
200添加亩升媒体到阱至填充到500 亩升每孔。孵育细胞在37℃下过夜，在CO 2 培养箱中培养。
第2天：嘌呤霉素的选择
用完整的介质具有0.5替换DMEM 亩克/ ml的嘌呤霉素（每孔1ml）中。

注：嘌呤霉素浓度的细胞- 类型从属，并且可以确定与药物杀死曲线（参见小号Tep的C2C）。

第3天- 第11天：杀死细胞
根据需要，用新鲜的含嘌呤霉素的DMEM培养基替换培养基，以清除死细胞，直到可见细胞集落并且可以手动计数（通常在1：1,000-1：3,000范围内）。
。计算滴度（感染单位/毫升慢病毒上清液）为例，如果40个菌落计数（平均）在1：1000稀释，则相当于40000 IU为20 MYU 大号接种物用在滴定分析在慢病毒细胞中等于2 x 10 6 IU / ml。

HIV-CRISPR文库转导
此步骤包括生成表达Cas9酶和sgRNA文库的细胞池，然后按照步骤A中产生的慢病毒原液转导并按照步骤B进行定量，每个靶细胞将携带一个整合的慢病毒HIV-CRISPR慢病毒基因组编码嘌呤霉素抗性，Cas9酶和该文库中的特定sgRNA。

第0天：细胞铺板和转导
板上的细胞被转导在一个12孔板中。对于贴壁细胞，细胞应在约75 Pasento 汇合。对于悬浮细胞，使用的浓度2×10个中6 细胞每孔在500 MYU 大号在12孔。
注：P 晚足够的细胞确保500 X 覆盖图书馆，这意味着每个因组在图书馆进行采样至少500次，求出数量的细胞转导，乘数的个人SgRNAs在库500。。对于实施例，该GeCKOv2全基因组文库包含123411个SgRNAs：因此，62 ×10个6 转导的细胞应定位。

DEAE葡聚糖添加向媒体做出最终浓度20 MYU 摹/ ml到提高转导效率。
注：牛逼。他浓度DEAE葡聚糖是最佳的增强转THP-1细胞的其他细胞类型，优化这一浓度的剂量反应，以确保最佳转导率，同时最大限度地减少细胞毒性。

添加适当体积的HIV-CRISPR文库慢病毒载体，以达到0.5-0.75的MOI，从而实现细胞群后选择，其中在该群中的大多数细胞中仅存在一个sgRNA（并因此产生基因基因）。
感染细胞通过旋感染（Spinoculation ）处理30分钟。在1100 ×g下在室温下在台式离心机随着摇摆斗转子/板适配器。添加500 Myueru 媒体到每个阱和孵育过夜。在37℃下在CO 2 培养箱。
注意事项：

由于慢病毒转导效率的变化，在其他细胞类型中，要使有效MOI达到0.5-0.75的慢病毒储备量可能会有显着差异，可以针对每个使用的细胞系进行此步骤的优化。适量的DEAE-葡聚糖和慢病毒储备液的各种稀释液可用于确定最佳转导条件的细胞类型。
大号Eftover慢病毒载体股票根本不使用此步骤可以冷冻回来一次没有出现重大损失滴度。
第一天
对于悬浮细胞，将转导细胞的所有孔合并在一个试管中，方法是用1 ml移液管重悬细胞（上下吸移以完全重悬每个孔中的所有细胞）并收集在F alcon 管中。确保没有细胞保持附着在孔的底部。对于粘附细胞，用胰蛋白酶消化细胞以将其从板中去除。
细胞5颗粒分钟，1 ，000 X ģ 。
细胞沉淀重悬在终浓度5×10中5 用0.5个细胞/ ml在完全RPMI（或其他媒体酌情）MYU ģ / ml的嘌呤霉素（或其它合适的浓度）。
注：牛逼。他浓度嘌呤霉素进行了优化，对于选择在THP-1细胞和其它浓度为适合不同的细胞类型，我们推荐使用嘌呤霉素浓度先前刊登在文学各细胞类型的兴趣点和所确定的由取消通过在未转导的细胞上添加递增浓度的嘌呤霉素来执行杀伤曲线，这允许确定培养物中选择嘌呤霉素几天后杀死100％细胞所需的最小浓度。

第2天- 第14天：HIV-CRISPR细胞文库选择
继续嘌呤霉素选择10-14天以选择转导的细胞，并允许CRISPR / Cas9介导的基因敲除发生。
每隔2-3天用含有嘌呤霉素的完全培养基替换培养基以扩增细胞，并始终保持选择的细胞。在适当的情况下，将细胞分裂，并始终保持足够的细胞数量，以确保充分覆盖文库（> 500 x ）。
选择完成后，将细胞用于实验，并将剩余的细胞冷冻在90％FBS和10％DMSO中，以用于将来的实验。

HIV-CRISPR文库细胞感染
生成的I细胞ň 过程C是感染了艾滋病病毒，以评估每个单基因敲在库的组件的影响S对于HIV复制。通常，屏幕为每个条件（即，病毒）做一式两份，增强屏幕效果。

0天
和板计数细胞以2×10 6 个细胞/ 500毫升亩升在12孔培养皿中。

注意：细胞可以在一天前用1000 U / ml重组通用I型干扰素α预处理24小时。

第一天
感染细胞在12孔板20 MYU 摹。/ ml的DEAE-葡聚糖不同的MOI可用于取决于目标实验结果（鉴定辅因子或限制因素;敏感性的表型饱和，低感染水平，等等。）。感染的总体积可能会有所不同，总体积越小感染率越高。
使用带有摆桶式转子/板适配器的台式离心机，以1，100 x g 的室温在室温下自旋感染（spinoculation ）30分钟以感染细胞。
添加500 MYU 大号隔夜媒体在每个孔中并温育于37℃在CO 2 孵化器。
第二天
细胞旋转5分钟，在1 ，000 XG 重悬他们媒体（含或不含干扰素如适用）。

第四天
收集细胞并收集以进行核酸提取，扩增和测序。

注意事项：

根据细胞系或所需的结果，可以使用不同的MOI或收集时间。
重要的剩余协议步骤：污染与质粒DNA，基因组DNA或扩增库可以成为一个问题，应采取措施，以减少在李Kelihood中污染用干净的移液管带过滤嘴，刚刚打开的试剂盒和试剂和专用罩和。每一步都应有长凳。

HIV-CRISPR细胞基因组DNA提取
从细胞中提取细胞基因组DNA，以便随后整合到细胞群中的HIV-CRISPR慢病毒基因组（包括sgRNA）的PCR扩增（步骤G）。

沉淀细胞旋转5分钟，在1 ，000 X ģ 分离细胞和病毒含上清液。保存上清液用于病毒RNA的提取（步骤F）。将该颗粒可以储存在4℃下几天（或冷冻在-80°C，尽管裂解变得更加困难）。
按照协议使用QIAamp DNA Blood Midi Kit 提取基因组DNA（gDNA ），并进行以下修改：
理想情况下，每次提取最多使用5 x 10 6个细胞（根据需要扩展至多次提取）。
在洗脱之前，请执行额外的离心步骤以除去尽可能多的乙醇（乙醇会抑制下游的扩增步骤）。
基因组DNA在洗脱250 MYU 大号ħ 2 ö代替提供。在血液DNA Midi试剂盒（其含有EDTA并能抑制下游扩增步骤）的缓冲区。
两个连续的250执行MYU 大号洗脱。洗脱保留1和洗脱2分离，并量化DNA使用NanoDrop（典型的收率是100-300纳克/ MYU 大号）。第二洗脱通常是较不集中，而更高效地扩增由于减少乙醇残留。
在-20°C或-80°C下冻结gDNA。

HIV-C RISPR病毒RNA提取
从纯化后的纯化物中收集HIV病毒粒子，并提取病毒粒子的病毒RNA，以便随后PCR扩增HIV-CRISPR病毒基因组RNA编码的sgRNA。

病毒上清当收集细胞分离在工序E以上。病毒上清可以存储对于长达一周的时间在4°C之前或之后过滤（见程序A或长期在-80°C）。
Supernata过滤NTS用0.22 微米米过滤器或具有Steriflip 50ml锥形管。
如步骤A 6中所述，将病毒颗粒浓缩在20％的蔗糖溶液上。在70,000 x g 下于4°C 离心1 h。
重悬病毒慢慢粒料在140 MYU 大号过夜4的PBS，并孵育℃，偶尔涡旋。
注意：此步骤可以在4°C下几个小时后执行。

转移至1.5 ml Eppendorf管中，如果不立即用于RNA提取，请在4°C下保存几天或在-80°C下冷冻。
按照协议使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒RNA ，并进行以下修改：
该步骤应在专用的RNA工作台上进行，用RNase彻底清洗工作台和移液器，并使用过滤器/隔离器尖端。
裂解期间不将载体RNA添加到缓冲液AVL中。
RNA病毒（vRNA的）被洗脱在40 MYU 大号缓冲AVE以促进下游反转录（RT）反应。
在-80°C下冷冻vRNA ，避免多次冷冻/解冻循环。

细胞基因组DNA HIV-CRISPR文库扩增
通过PCR从细胞基因组DNA 中扩增细胞池中整合的HIV-CRISPR载体中存在的sgRNA序列（步骤E）。用于扩增的引物位于可变sgRNA序列的侧翼，导致HIV中存在的所有sgRNA序列的扩增均一。 -CRISPR细胞文库。细胞基因组DNA中sgRNA序列的文库表示用于在筛选数据分析过程中标准化数据（步骤L）。

在冰上解冻分离的基因组DNA（gDNA）制备物（来自规程E）和PCR试剂。
计算量的gDNA以扩增为了确保约500 X 覆盖库（使用估计的6.6 PG 的总基因组DNA每个细胞平均）的数目和PCR反应来执行，最多可使用2 MYU ģ 基因组DNA每个PCR反应中要确保最有效的扩增。例如，对于该壁虎V2库C Ontaining 123411个SgRNAs，A 500 X 覆盖对应于6.17×10个7 细胞或410 MYU ģ 中的DNA。在这种情况下，执行205 PCR反应。
对HIV-CRISPR慢病毒基因组进行PCR，获得445 bp 的PCR 1 产物（图2）.PCR反应设置如下（表1）：
注意事项：

所用引物的列表可在补充手册中找到。
PCR反应制备小号是完成在一个专用的，DNA-免费清洁区或带罩专用，质粒免费移液器避免污染扩增中。

表1.首轮PCR（PCR1）

组成部分

50 Myueru 反应

PCR反应设置

gDNA（来自程序E）

2 MYU ģ

底漆R1_forward（10 MYU 中号）

1.25 MYU 大号

底漆R1_reverse（10 MYU 中号）

1.25 MYU 大号

100毫米dNTP

0.5 MYU 大号

缓冲液

10 MYU 大号

二甲基亚砜

2.5 MYU 大号

大力神

1 MYU 大号

高氧2

50向上MYU 大号

热循环条件

95°摄氏度

2分钟

95°摄氏度

15秒

x12

60°摄氏度

20秒

72°摄氏度

30秒

72°摄氏度

3分钟

4°摄氏度

保持

在一起的所有50联合MYU 大号PCR1反应在单管。
注意：在此步骤中要汇集的PCR1反应的总数会有所不同，具体取决于扩增的基因组DNA的总量（在步骤G 2中确定）。

按照试剂盒说明使用QIAquick PCR清理试剂盒清理PCR1池：
http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf。

注：我们通常池中，直到12个PCR反应对单个列和洗脱我ñ50 Myueru h的2 Ø 这允许浓度PCR1产品，同时减少了数各列需要并且避免饱和列（即。结合高达罐10 MYU ģ 中DNA 根据制造商的说明书）。

合并清理的PCR1反应以创建清理的PCR1池。
进行PCR2反应，导致PCR2产物扩增（大小= 230 bp）.PCR 反应设置如下（表2）：
注意小号：

进行四个PCR2反应以扩增足够的产物用于HTS的纯化和合并，同时还避免了可能在单个PCR反应中引入的PCR偏差。
Ë 乙酰胆碱样品（基因组DNA复制）必须被放大了一个独特的条形码的索引底漆（这些是“R2_IndexX”引物组）应加倍小心注意避免交叉污染索引引物，这将导致误分配的在条形码解复用时读取。使用的引物列表可在Supplemental中获得。如果需要，可以设计和使用其他自定义引物组。

表2.第二轮PCR（PCR2）

组成部分

50 Myueru 反应

PCR反应设置

gDNA PCR1池

5 MYU 大号

[R 2 _ IndexX 引物（10 MYU 中号）

1.25 MYU 大号

[R 2 _Reverse引物（10 MYU 中号）

1.25 MYU 大号

100 毫米dNTP

0.5 MYU 大号

缓冲液

10 MYU 大号

二甲基亚砜

2.5 MYU 大号

大力神

0.5 MYU 大号

高氧2

29 MYU 大号

热循环条件

95 °摄氏度

2 分钟

95 °摄氏度

15 秒

x 2 0

60 °摄氏度

20 秒

72 °摄氏度

30 秒

72 °摄氏度

3 分钟

4 °摄氏度

保持

可以通过在2％TBE分析凝胶（230 bp产物）上进行少量PCR2反应来验证PCR扩增。
ñ OTES：

随身携带的PCR1产物（在第一轮PCR中扩增的445 bp产物）可能仍然可见，但不会影响下游合并和HTS，因为在库清理（过程I）过程中会去除大部分这种产物。影响准确定量，但不包含HTS必需的序列，因此不会干扰测序（过程K）。
TBE（与TAE相对）使230 bp扩增子更容易可视化，但不应用于凝胶纯化。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902432--1364莫莉·奥海因735131 \图jpg \图2.jpg

2图。第1轮（PCR1）和第2轮（PCR2）的扩增子。A. 放大视图的HIV-CRISPR序列示与R1（PCR1）和R2（PCR2）引物结合位点的映射。一种实施例20 BP因组显示序列中的HIV-CRISPR载体骨干。B. 举例凝胶显示预期PCR2扩增子（230 BP）。请注意，一些445 BP PCR1扩增子产品也是可见的。

合并所有PCR2反应以创建gDNA PCR2池，包括所有四个PCR2反应，如步骤G 7所示。
在-20°C或80°C下冻结gDNA PCR2池。

病毒RNA HIV-CRISPR文库扩增
通过PCR扩增包装的HIV-CRISPR病毒基因组中编码的sgRNA（被HIV 反式包装），从而可以测量病毒体中每种sgRNA的相对频率。

注意：PCR反应的制备是在无DNA的专用清洁区域或装有专用无质粒的移液管的通风橱中进行的，以避免扩增过程中的污染。

病毒RNA解冻（vRNA的从程序F），该的SuperScript II逆转录酶试剂盒和的Herculase PCR试剂冰上。
如下进行病毒RNA的逆转录（表3）：
注意：所用引物的列表可在补充资料中找到。

表3. RT

组成部分

20 Myueru 反应

vRNA （来自程序F）

10 MYU 大号

底漆R1_reverse（10 MYU 中号）

1 MYU 大号

10毫米dNTP

1 MYU 大号

5个FS缓冲区

4 MYU 大号

10万DTT

2 MYU 大号

RNaseOUT

1 MYU 大号

在65°C下于室温下将RT反应孵育5分钟热循环仪，然后放在冰上。
1个添加MYU 大号的标II酶每个RT反应。
注意：通过小心地上下吸打以防止气泡混合均匀，这一步骤是确保充分混合试剂以最大效率扩增所有HIV-CRISPR病毒RNA模板的关键。

如下在热循环仪中孵育：
42°C 50分钟

70°C 15分钟

汇集所有RT反应以创建vRNA RT池。
接着，PCR1扩增逆转录的Vir 的Al RNA的cDNA 是进行与基因组DNA扩增（表4）。

表4. RT的第一轮PCR（PCR1）

组成部分

50 Myueru 反应

PCR反应设置

vRNA RT池

10 MYU 大号

底漆R1_forward（10 MYU 中号）

1.25 MYU 大号

底漆R1_reverse（10 MYU 中号）

1.25 MYU 大号

100毫米dNTP

0.5 MYU 大号

缓冲液

10 MYU 大号

二甲基亚砜

2.5 MYU 大号

大力神

1 MYU 大号

高氧2

23.5 MYU 大号

热循环条件

95°摄氏度

2分钟

95°摄氏度

15秒

x 12

60°摄氏度

20秒

72°摄氏度

30秒

72°摄氏度

3分钟

4°摄氏度

保持

8 PCR1最多的反应是一起收集并清理使用单个列QIA快速PCR清理试剂盒，以50 MYU 大号最终洗脱体积（vRNA的PCR1池）。
12.5 MYU 大号的vRNA的PCR1池作为模板在四PCR2反应（表5）：
ñ OTES：

Ë 乙酰胆碱样（vRNA的复制）必须被放大了一个独特的条形码的索引底漆（这些是“R2_IndexX”引物组）应加倍小心注意避免交叉污染索引引物，这将导致误分配的读取在条形码解复用期间使用的引物列表可在Supplemental中获得。如果需要，可以设计和使用其他自定义引物组。
进行四个PCR2反应以扩增足够的产物用于HTS的纯化和合并，同时还避免了可能在单个PCR反应中引入的PCR偏差。

表5.第二轮PCR（PCR2）

组成部分

50 Myueru 反应

PCR反应设置

vRNA PCR1池

12.5 MYU 大号

R2_IndexX （10 MYU 中号）

1.25 MYU 大号

R2_reverse （10 MYU 中号）

1.25 MYU 大号

100 毫米dNTP

0.5 MYU 大号

缓冲液

10 MYU 大号

二甲基亚砜

2.5 MYU 大号

大力神

0.5 MYU 大号

高氧2

21.5 MYU 大号

热循环条件

95 °摄氏度

2 分钟

95 °摄氏度

15 秒

x12

60 °摄氏度

20 秒

72 °摄氏度

30 秒

72 °摄氏度

3 分钟

4 °摄氏度

保持

扩增可以成为PCR验证通过运行少量（即，5 MYU 大号的PCR2反应在2 Pasento分析TBE凝胶（参见图2：230 bp的产品））。
注：开展，通过PCR1产品（445 bp的产物）可能仍然可见，但应该不会影响到下游池和HTS作为大多数商品被移除在图书馆清理（程序我。）中进行- 通过Produc 牛逼可能影响准确定量但是不包含HTS必需的序列，因此不会干扰测序（过程K）。

将所有P CR2反应合并在一起以创建vRNA PCR2库。
在-20°C或80°C下冷冻vRNA PCR2池。

磁带库清理：双面SPRI
测序前先清理各个文库，以除去过量的引物和其他非特异性产物（包括可能通过的PCR1产物）。双面固相可逆固定化（SPRI）可以完成此操作，但其他方法（例如凝胶纯化）可以此处使用的珠子：DNA 比率可充分分离测序中使用的230 bp扩增子，但其他比率也可能合适。

充分涡旋适当体积的AMPureXP 磁珠，使其达到室温。
PCR2池与混合珠在0.8 X 比（例如，40 MYU 大号中DNA对于32 MYU 大号珠），涡旋5 S.
孵育对于5米在室温下。
将试管放在磁力架上，孵育5分钟。
将上清液转移到新试管中，而不会干扰小珠。
使上清液孵育之前的步骤用珠子在1.5 X 比（例如，50 MYU 大号的上清液用75 MYU 大号珠）。涡旋5 S和孵育5分钟在室温下。
将试管放在磁力架上5分钟，然后用移液器小心取出并丢弃，不要干扰磁珠。
200添加MYU 大号80 Pasento乙醇（制作新鲜的），保持管内的磁性支架。孵育30秒和取下并丢弃Supernantant 。
可选：重复步骤我7一个更多的时间。
风干磁铁上的磁珠5分钟，但不要再干燥（避免使DNA /磁珠混合物过度干燥）。
该管从取出磁铁，重悬珠在45 MYU 大号核酸酶，游离H 2 O.
涡旋DNA /珠混合5秒钟，并在室温下孵育2分钟。
将磁架上3分钟，小心地转移35。MYU 大号上清至新管的不结转珠上清应该出现清除;如果没有，重复此步骤，摆脱剩珠。
将清理后的库存储在-20°C或-80°C下（或在4°C至少保存几周）。

图书馆量化
扩增子库的需要进行精确量化的前池和测序最大限度地排序输出中适配器-并且因组含扩增DNA在高通量测序（HT S）（程序大号）。精确定量文库DNA做与量子比特HS套装双链DNA ，将增强通过校准荧光与所提供的校准标准每次试验中进行。量子位的dsDNA HS检测试剂盒制造商的协议：

asset.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf。

按照Qubit dsDNA HS Kit的说明，对每个清理的PCR2文库样品中存在的dsDNA进行定量，如下所示：
通过在提供的缓冲液中稀释Qubit试剂1：200来制备Qubit溶液。
每种样品，加入2 MYU 大号样品198 MYU 大号的缓冲液稀释。
在Qubit上读出每个样品中dsDNA的定量并进行记录。

合并库以进行高通量测序
在此步骤中，通过高通量测序（HTS）对先前制备的扩增子文库进行测序。通常使用Illumina miSeq 或HiSeq对文库进行测序，但其他HTS 方法也可能适用。

计算所有清理库的浓度，并转换为nM 。
示例有关，对于扩增子大小为230 个碱基，1毫微克/ MYU 大号等同于浓度6.59 NM 。

用无核酸酶的H 2 O或其他合适的稀释液将文库稀释至2 nM 的终浓度，以用于您的测序方法。
将单个2 nM 文库集中在一个试管中，以创建最终的2 nM库进行测序。

HIV-CRISPR库的高通量测序（HTS）
在此步骤中，通过高通量测序（HTS）对先前扩增，纯化和定量的扩增子文库进行测序，可以使用Illumina miSeq 或HiSeq ，但其他HTS 方法也可能适用。

注意事项：

miSeq 运行的典型输出通常是HiSeq 快速运行通道的典型输出的20％，但是根据屏幕的不同，miSeq 可能就足够了。所需的测序深度取决于许多因素，包括精确的实验设置最多，强度选择和效率的核酸提取/放大/清理。通常情况下，我们得到1-5万元每读取样品，这是绰绰有余了。了解更多关于如何确定合适的测序深度，可以发现在制造商的网站：Illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/coverage.html。
为了避免低多样性样品引起的序列质量问题（扩增子测序中常见的问题），可能需要添加PhiX DNA.PhiX 峰至少20％是有用的起点，并且可以进一步优化以获得更多的测序深度。由于使用当前的扩增方案/引物对进行HIV-CRISPR测序需要50个循环，因此我们在单读50（SR50）设置中使用HiSeq 或miSeq 。

HIV-CRISPR 筛选分析
。各种数据分析方法都可以用来分析CRISPR屏幕数据的目标，这个方案被为了鉴定一个Ffecting HIV复制：因此，我们的数据分析方法的目的是计算可基因敲铅小号牛逼Ø增加或减少HIV感染：为此，我们计算了病毒体包装的HIV-CRISPR基因组中每个sgRNA序列与整合在细胞中的HIV-CRISPR基因组中编码的sgRNA序列相比的相对频率，假设靶向抗病毒因子的sgRNA将会富集病毒所需的病毒因子和sgRNA中靶向辅因子的因子或sgRNA中的sgRNA会在病毒级分中消失。下面介绍的统计方法可以考虑到所有靶向单个基因的sgRNA，从而为每个基因分配得分。

分析流程示例：使用Illumina的bcl2fastq转换软件将原始BCL文件转换为FASTQ文件，然后使用FASTX Toolkit条形码分离器对FATSQ文件进行多路分解以将读取分配给不同的样品。 20 bp变异sgRNA序列并使用Bowtie （Langmead 等，2009）与sgRNA库进行比对。作为阴性对照，可以将NTC（非靶向对照）sgRNA序列进行迭代装箱，以创建一个与组基因在因组文库本身。相对富集或耗尽SgRNAs和基因成绩被确定与MAGeCK 统计软件包使用默认参数（李等人。2014）。MAGeCK 考虑到富集所有SgRNAs对一个基因的跨越复制数据为每个基因分配MAGeCK 基因得分。分析数据集的例子可以在我们的原始出版物中找到（OhAinle 等，2018）。

注意：重复的CRISPR / Cas9筛选往往会产生可重复的结果（对于gDNA复制，r 2 值> 0.9，对于vRNA 复制可> 0.8 ）。最可靠的结果是实验中保留的结果。可由于缺乏取样图书馆在各个步骤的过程中：足够的感染细胞，高效的核酸提取，测序深度（即，没有足够的阅读深度。），或其它实验变量重复，程度之间的关系非靶标对照（NTC）sgRNA 的富集情况，得分最高的命中的MAGeCK 基因总得分，p值和错误发现率（FDR）（与“ NTC基因集”相比）是评估质量的良好指标但是，必须对所发现的任何命中值进行验证，以确定真正的信噪比截断（即，根据经验得出）。为避免污染的风险，请尽可能使用新的试剂盒和试剂。

菜谱

10 x Tris / B orate / EDTA（TBE）运行缓冲液（500 ml）
54克Tris碱

27.5克硼酸

20 ml的0.5 M EDTA

Adju 圣pH至8.3通过加入HCl

1个稀释X 在水之前电泳

20％蔗糖溶液（200毫升）
40克蔗糖

400 Myueru 的0.5M EDTA

4毫升1 M HEPES

5毫升4 M氯化钠

使用Steriflip 50 ml锥形管过滤，并在4 °C下保持无菌长达一年

EDTA库存保持在4°C

致谢

这个协议首先描述OhAinle 等人。（2018）。为制定该协议的工作是支持由美国国立卫生研究院资助R01 AI147877（MO），A CCEH试点格兰特P30 DK56465（MO）和UW / FHCRC CFAR新科学家奖PIKA HIV 库的建设得到了Julie Over baugh 的DP1 DA039543的支持，比利时的Jolien Vermeire的美国教育基金会奖学金和Michael Emerman的R01 AI30927的支持。我们感谢Emily Hsieh和Vanessa Montoya在编辑P30 AI027757（MO）方面的帮助。协议;帕特里克· 帕迪森（Patrick Paddison），菲尔·科林（Phil Corrin）和卢卡斯·卡特（Lucas Carter）提供技术建议，Fred Hutch Genomics共享资源和迈克尔· 埃默曼（Michael Emerman）支持开发HIV-CRISPR筛选方法。

竞争利益

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

凯恩，M.，藏，TM，Rihn ，SJ，章，F.，许克，T.，阿利姆，M.，Schoggins ，J.，水稻，CM，威尔逊，SJ和Bieniasz ，PD（2016）。鉴定具有抗逆转录病毒活性的干扰素刺激基因，细胞宿主微生物20（3）：392-405。
Langmead，B.，Trapnell ，C.，Pop，M.和Salzberg ，SL（2009）。短DNA序列与人类基因组的超快速和内存高效比对。Genome Biol 10（3）：R25。
Li W.，Xu，H.，Xiao，T.，Cong，L.，Love，MI，Zhang，F.，Irizarry，RA，Liu，JS，Brown，M. and Liu，XS（2014）。MAGeCK可从基因组规模的CRISPR / Cas9敲除筛选中可靠地鉴定必需基因。Genome Biol 15（12）：554。
Liu，L.，Oliveira，NM，Cheney，KM，Pade ，C.，Dreja ，H.，Bergin，AM，Borgdorff ，V.，Beach，DH，Bishop，CL，Dittmar，MT和McKnight，A.（2011 ）。对HIV限制因子进行全基因组筛选。逆转录病毒学8：94 。
OhAinle，M.，Helms，L.，Vermeire，J.，Roesch，F.，Humes，D.，Basom，R.，Delrow，JJ，Overbaugh，J.和Emerman，M.（2018）.A病毒-可包装的CRISPR筛选可鉴定介导干扰素对HIV抑制的宿主因子， Elife 7：e 39823。
Schoggins，JW，威尔逊，SJ，潘尼斯，M.，墨菲，MY，琼斯，CT，Bieniasz，P.和米饭，CM（2011）。不同范围的基因产品是效应物的I型干扰素的抗病毒反应。自然472（7344）：481-485。