材料和试剂

1毫升针筒，带5/8英寸长，25号针头
5毫升和10毫升血清移液器
用于血清移液的移液器（例如Drummond移液器）
无菌15和50 ml锥形离心管
无菌12 x 75聚苯乙烯弹簧盖培养管（猎鹰，目录号：352054）
带细胞滤网盖的无菌12 x 75聚苯乙烯培养管（Falcon，目录号：352235）
无菌组织培养瓶（T-25和T-75）
培养处理组织100毫米直径的聚苯乙烯P ETRI板
无菌，无组织培养处理100个45mm聚苯乙烯P ETRI板
高压灭菌的带有玻璃末梢的显微镜载玻片（将铝箔包裹在铝箔中，在载玻片之间有小段，以利于高压灭菌后的分离）
Sphero TM 2.22 µm聚苯乙烯磁珠（Spherotech，Green Oaks，伊利诺伊州，目录号：PM-20-10），在室温下存放
Sphero TM 3.75 µm链霉亲和素涂层磁性颗粒（Spherotech，伊利诺伊州奥克斯市，目录号：SVM-30-10）
野生型小鼠充当原代小鼠脾细胞和骨髓的供体，以及过继转移的T细胞和/或抗原免疫的受体。
AND或5C.C7 T细胞抗原受体转基因小鼠（或其他TCR转基因，如果需要的话）
步骤A1中所述的骨髓衍生树突细胞（BMDC）.P 修复
MCC：FKPB转染的成纤维细胞APC （Wetzel 等，2005 ）。
EZ-Link Sulfo-NHS-生物素（Thermo Scientific，Waltham，MA，目录号：A39256）
纯化的抗体可分析T细胞表型和感兴趣的吞噬细胞分子，例如：
一个NTI-CD4的AlexaFluor 700（克隆RM4-5，Biolegend公司，目录数量：100536 ）
一个NTI-CD69 PE-Cy7的（克隆H1.2F3，Biolegend公司，目录数量：104512 ）
一个NTI-CD80太平洋蓝（16-10A1，Biolegend公司，目录编号：104724 ）
一个NTI-CD86 APC（克隆GL1，Biolegend公司，目录号：105012）
甲NTI-IA / IE亮紫421（克隆M5 / 114.15.2，BioLegend公司，目录号：107632 ）
刺激T细胞，纯化，叠氮化物免费抗CD3（克隆145.2C11，Biolegend公司，目录号：100302）和抗CD28（克隆37.51，Biolegend公司，目录号：102112）
要检测被T细胞吞噬的生物素标记的APC膜蛋白，需使用荧光染料偶联的抗生蛋白链菌素（PE-Dazzle 594，BioLegend ，目录号：405248）。抗IE k PE（克隆17-3-3，Thermo Fisher，目录号）：确切的抗体将由所采用的实验参数确定。
Zombie Aqua Fixable可行性染色剂（BioLegend，目录号：423101）。将等分试样储存在-20 ° C，保存期限〜1年
注意：进行细胞内染色时，固定的活/死染色至关重要。

Lympholyte-M （Cedarlane Labs，目录号：CL5035 ）。在黑暗中于4 ° C存放，保质期〜5年
台盼蓝溶液（0.4％于磷酸盐缓冲盐水中）（Sigma，目录号：T6416）
粉末状RPMI 1640介质（不含L-谷氨酰胺或NaHCO 3 ）（Sigma，目录号：R6504）
胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物公司，目录号：S1550）
1 mM L-谷氨酰胺（Sigma，目录号：G6784）
100 mg / ml丙酮酸钠（Sigma，目录号：S8636）
MM 50 Beta版巯基乙醇（Sigma，目录号：P7522）
必需氨基酸（Sigma，目录号：M5650）
非必需氨基酸（Sigma，目录号：M7145）
100 U / ml青霉素G（Sigma，目录号：P3032）
100 U / ml链霉素（Sigma，目录号：S9137）
50 mg / ml庆大霉素（Sigma，目录号：G1264）
Dulbecco的改良Eagle媒体（DMEM）（Sigma，目录号：M0518）
重组鼠粒细胞/单核细胞集落刺激因子（Peprotech，目录号：315-03）
Sigma佐剂系统（Sigma，目录号：S6322）
500 µM蛾细胞色素c 88-103（MCC 88-103 ）抗原肽*溶液（在PBS中，pH 7.4）Genscript（新泽西州皮斯卡塔韦）
注意：*为实验系统选择合适的肽（确保它与特定的II类MHC分子以及特定的转基因T细胞抗原受体结合（如果使用））。

鸡蛋中的白蛋白（卵清蛋白）（Sigma，目录号：A5503）
EDTA（Sigma，目录号：ED2SS）
牛血清白蛋白，馏分V（西格玛，目录号：A9647）
甲醇（Fischer Scientific，目录号：A452-4）
多聚甲醛（Sigma，目录号：P6148）
皂苷（EMD密理博，目录号：558255）
NH 4 Cl（Mallinckrodt Baker，目录号：3384-12）
KCl（Mallinckrodt Baker，目录号：6858-04）
Na 2 HPO 4 （Mallinckrodt Baker，目录号：4062-01）
KH 2 PO 4 （Sigma，目录号：P9791）
葡萄糖（Sigma，目录号：G7021）
酚红（Sigma，目录号：P3532）
NaOH（Fischer Scientific，目录号S318）
HCl（Mallinckrodt Baker，目录号：9535-05）
MgCl 2 ·6H 2 O（Sigma，目录号：M2393）
用MgSO 4 ·7H 2 O（Sigma，目录编号：M5921）
CaCl 2 （无水）（Sigma，目录号：C1016）
NaHCO 3 （Sigma，目录号：S5761）
甘氨酸（Sigma，目录号：G8790）
1 X 胰蛋白酶- EDTA溶液（Sigma，目录号：59430C）
海卫一X-100（Sigma，目录号：T9284）
盖伊的解决方案A （请参阅食谱）
盖伊的解决方案B （请参阅食谱）
盖伊的解决方案C （请参阅食谱）
1倍Gey的低渗溶液（请参阅食谱）
具有Joklik修改（S-MEM）的微调器基本必需中鹰（Sigma，目录号：M0518）（请参阅食谱）
完整的媒体补充（请参阅食谱）
完整的RPMI（cRPMI）（请参阅食谱）
完整的DMEM（cDMEM）（请参阅食谱）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（请参阅食谱）
1x无菌磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4 （请参见食谱）
1x无菌磷酸盐缓冲盐水，pH 8.0 （请参见食谱）
流式细胞仪染色缓冲液（请参见食谱）
10％叠氮化钠溶液（NaN 3 ）（请参阅食谱）
4％多聚甲醛（请参阅食谱）

配套设备

2 L烧杯
干细胞TM EasySep TM 磁铁（干细胞，目录号：18000）
P 10，P 20，P 200和P 1000微量移液器和无菌移液器
温度控制的加湿细胞培养培养箱（5％CO 2 环境）
层流II级生物安全柜
冷藏台式离心机
血细胞计数器和手计数
具有4倍，10倍和20倍物镜的倒置相衬显微镜
多色流式细胞仪（例如Becton Dickinson ，型号：FACSAria）
用于离线数据分析的计算机（Apple iMac或MacMini）
通风柜
带有集成搅拌电机的加热板
搅拌棒
Nitex筛网，60 µm 筛孔（Elko过滤公司，目录号03-60 / 42）
注意：切成1英寸的正方形，用于在流式细胞仪之前滤出细胞团块，必要时可以高压灭菌。

软体类

FlowJo 8.8.7和FlowJo 10软件（Tree Star，Ashland或俄勒冈州）

程序

在光凝作用测定的前一天或当天准备APC（包括表面生物素标记）
注意：许多不同的抗原呈递细胞类型可用于光凝作用分析中，我们主要使用肽脉冲的原代骨髓树突状细胞（BMDC）或转染的鼠成纤维细胞表达CD80，ICAM-1和与抗原i共价连接的MHC II类分子c肽通过柔性接头（Wetzel等，2002 ）。BMDC 在cRPMI 中生长，而成纤维细胞APC在cDMEM中生长。

为了产生BMDC，培养骨髓细胞中分离从小鼠股骨和6天在无菌100 毫米直径的非组织培养P ETRI菜肴10个5 细胞/ mL CRPMI培养基含有30 ng / ml的重组鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（PeproTech，Rocky Hill，NJ）在37°C和5％CO 2下。在第3天添加新鲜培养基和GM-CSF，并在第6天收获非贴壁细胞。激活这些非贴壁细胞细胞通过电镀在组织培养包被的6孔板加适马佐剂系统在125 毫微克/毫升18 H使用前（稻叶等人，1992年和2009年）。所得的贴壁细胞表面生物素化（如上所述在A4 - A6）和外源性装载有抗原肽加入肽溶液（至终浓度2.5 。MyuM）要BMDC培养至少2小时，使用前得到的贴壁细胞群为> 90 Pasento 的CD11c Tasu （Reed和韦策尔，2019 ）。
APC为70-80成长Pasento合流在组织培养级瓶或P ETRI菜肴。经过表面生物素，典型的恢复活APC是〜70 Pasento。
从装有0.2％EDTA的PBS或细胞刮刀的烧瓶/板中移出APC，可以使用胰蛋白酶-EDTA，但要确保目标分子不是理论裂解的目标。
从培养基中除去蛋白质通过WA 盛细胞〜1×10 6 个细胞/ ml，洗3次，我ÑpH 7.4的PBS，离心细胞，在500 ×g下5分钟在15ml锥形管中，倾析上清液，重悬细胞沉淀，并重复用于最后的洗涤可以在PBS pH 8.0或0.1 M碳酸盐缓冲液中进行，具体取决于推荐的标记特定底物的缓冲液。
根据NHS-LC-Biotin制造商提供的规程重悬细胞（通常在0.5和1 x 10 7个细胞/ ml之间）在含有0.1 mg / ml NHS-LC-Biotin试剂的PBS pH 8.0中重悬。在室温下孵育15- 20分钟
注意：尽管可以在4 ° C 标记细胞以最小化生物素化蛋白质的内在化，但这通常不是必需的。

用10倍体积的含100 mM甘氨酸的PBS pH 7.4淬灭反应，在15 ml锥形管中以500 xg离心5分钟，然后在相同的100 mM甘氨酸缓冲液中再次洗涤5分钟，然后离心。
在含有10％FBS的细胞培养基中重悬细胞，并使用台盼蓝排除法对活细胞计数。
此时，可将细胞铺板并干燥过夜，以在第二天使用，也可以在同一天使用，前提是要有足够的时间（〜2小时）使APC牢固粘附在表面上。用作APC时，此孵育时间不是必需的。我们发现，在trogocytosis试验期间，T细胞：APC的比例为2.5：1可以有效刺激T细胞（4），尽管这个数字可能会被滴定，并且之间的比例10：1和1:10 T：如果需要，可以使用APC。
APC的铺板：以0.25 x 10 6个细胞/ ml 重悬细胞，并在6孔板中以2 ml /孔培养板（假定细胞系的细胞倍增时间为〜12 h）。如果原代骨髓来源的树突状细胞（BMDC）或在同一天进行光凝作用，在光凝试验时将浓度加倍至0.5 x 10 6 细胞/ ml，最终计数为10 6 细胞/孔。在cDMEM中培养cRPMI和转染的成纤维细胞。
如果用肽加载细胞，则可以在APC铺板时或在进行细胞吞噬作用分析之前1-2小时以所需浓度添加肽。
激活APC为，板BMDC在组织培养处理板或P ETRI-菜肴和六西格玛添加佐剂系统或模式识别受体（PRR）激动剂，如LPS，在当时APC电镀。
37温育细胞° 在5％COÇ 2 ü 在Trogocytosis测定NTIL使用。
（可选）如果需要在吞噬作用分析后对吞噬性APC进行磁分离，则可以在APC铺板之前（上述步骤A1）将2.22μm磁性聚苯乙烯磁珠立即添加到培养物中，最终浓度约为0.01％w / v。使用材料部分中列出的Spherotech磁珠时，建议的体积为5 µl /孔。所需的浓度会因APC类型而异，如所述，应进行滴定以建立最佳浓度，然后进行光吞作用。如果数量太高。，它可能会导致死亡APC由于对内部化。可视化APC使用10 X 目标上的倒置显微镜之前Trogocytosis-分析，一般4-10珠/ APC结果在高效磁选。珠子直径在1 / 10 钍和1/4 钍的直径的细胞，而且非常易于观察。另外，磁珠可加2-6 ^ h之前Trogocytosis分析，但是过夜培养典型的是y 铺板每个孔之前要充分混合，因为磁珠会迅速沉淀到试管底部。

T细胞母细胞的制备
用1 ml /孔的PBS pH 7.4预涂6孔板，其中含有1或2 µg / ml的抗CD3和抗CD28。通过轻轻旋转板确保每个孔的整个表面都被缓冲液覆盖。通常使用贫血的脾脏培养物作为T细胞来源，但如果使用纯化的T细胞培养物，则可在T细胞铺板时添加CD28。为获得最佳的孔包被，请使用石蜡膜密封板以最大程度地减少蒸发并孵育板在4 ° C下过夜，如果需要，也可以通过在37 ° C 下孵育板至少2小时来进行包被。
注意：作为抗体包被孔的替代方法，可以使用抗体包被的珠子，但我们没有这种技术的经验。不推荐使用可溶性抗CD3，因为它可能导致无反应诱导而不是活化（Smith等。，1997 ）。

在将T细胞添加到抗CD3 +抗CD28包被的孔中之前，在生物安全柜（组织培养罩）中除去包被缓冲液并让孔完全干燥。
收集脾（S）捐助动物产生单细胞悬浮液通过破裂胶囊轻轻之间无菌显微镜载玻片毛玻璃（标签）第磨。这样做是在无菌P ETRI菜，细胞释放到大约10毫升cRPMI。收集脾脏和制备单细胞脾细胞悬液所需的技术在Wetzel 等人，2002和2005；Doherty 等人，2010； Osborne and Wetzel，2012；Thueson 等人，2015中进行了描述。
混合脾彻底和过滤碎片通过60 MYU 中号无菌Nitex筛网或过滤器，顶管，或者允许碎屑沉在底部的锥形管转移细胞悬液，一个新的15毫升离心管之前，如果碎片不会被删除，培养中的细胞会粘附在其上，这可能会大大降低其活化和/或细胞回收率。
用Gey's缓冲液裂解红细胞（RBC）。将细胞沉淀重悬于5 ml Gey's溶液中，在室温下孵育5-10分钟或在37孵育5分钟 °C。加入等体积的cRPMI并以500 xg 离心5分钟，得到的细胞沉淀应为灰白色，顶部可能有一层薄薄的红血球。（表示RBC裂解不足），重复此步骤。
如果需要的话，此时可以使用所需方法通过阴性选择CD8 + T细胞和其他不需要的细胞类型来产生纯化的CD4 + T细胞，这对于整个脾细胞培养是不必要的，通常> 90％的回收的活细胞在Ab刺激期之后的细胞是T细胞。
在cRPMI中将细胞浓度调整为1.25 x 10 6 T细胞或1.5 x 10 6 总脾细胞/ ml。
在预涂板的每个孔中加入2 ml细胞悬液。
将细胞在37 ° C下孵育36-48 h。在24 h时检查细胞，并确保T细胞粘附在孔的底部，这与激活一致。如果T细胞漂浮且其细胞质稠密或呈锯齿状。当使用倒置显微镜以10倍观察时，细胞尚未激活，必须终止实验并随后重新开始。
在36-48小时时，用孔中的培养基轻轻冲洗孔，以从6孔板中取出细胞，然后放入新的未包被的6孔板或cRPMI中的组织培养瓶中。
注意：如果媒体变成酸性（即，酚红培养基含有变成黄色），加入1/3体积和等体积的新鲜CRPMI为文化之间不添加多于等量的新鲜媒体的关键细胞因子，因为IL-2会被稀释并且细胞不会继续增殖。每12-24小时检查一次培养基，直到进行光吞试验。

从含有抗体的培养板中取出后，Ab生成的胚细胞可以使用2-4天。由于T细胞激活状态的增强，使用前2天可能会导致更高水平的非抗原特异性吞噬作用。
在用于光着细胞作用测定之前，立即使用室温Lympholyte-M（最适合小鼠淋巴细胞）通过密度离心从T细胞培养物中去除死细胞。
在室温RPMI中以0.5 x 10 7 -1 x 10 7 细胞/ ml 重悬T细胞。为了避免细胞结块，建议在此步骤中使用无血清培养基。如果培养物包含<2.5 x 10 7 细胞，重悬于5将15 ml锥形管中加入5 ml T细胞培养物，用移液器在T细胞下方轻轻铺在5 ml Lymphocyte-M下方，注意避免大气泡，否则会破坏T细胞-Lympholyte界面。
离心管中含有以1000 xg 浸有淋巴细胞的细胞15分钟，在培养基- 淋巴细胞界面（剩余的悬浮在培养基层中）中发现了约85％的活淋巴细胞，死细胞和非淋巴细胞将在此处沉淀。试管底部小心收集培养基中的细胞：使用无菌的巴斯德玻璃移液管或P1000微量移液管将淋巴液界面转移至新的15 ml锥形管中，注意将少量的淋巴液转移至新管中。存活的淋巴细胞将在随后的洗涤步骤中沉淀。以500 x g 离心5分钟。在cRPMI中洗涤细胞1次。
在预热的cRPMI中重悬细胞沉淀，并计数存活的回收T细胞。
在预热的cRPMI 中将浓度调整为1.25 x 10 6个细胞/ ml，并进行体外细胞吞噬试验
幼稚T细胞的制备
收集脾脏并匀浆，然后如上所述进行RBC裂解。
通过使用生物素化抗体混合物（抗MHC，抗B220 等）进行阳性选择，然后与抗生蛋白链菌素包被的微珠和磁性去除标记的细胞一起孵育，可以从培养物中去除APC和其他不需要的细胞。在该步骤中获得所需（即CD4 + T）细胞的富集培养。
（可选）在此步骤中，Lympholyte-M也可用于富集淋巴细胞。
一旦获得富集的T细胞培养物，将细胞以1.25 x 10 6 细胞/ ml的浓度重悬于cRPMI中，并进行体外细胞吞噬试验

体外滋养作用测定
*关键步骤*从孔中去除非粘附性APC和磁珠如果添加T细胞时存在非粘附性/死性APC，T细胞将粘附在这些团块上形成大的聚集体。在约45度角的孔中从上至下运行预热的PBS pH 7.4，轻轻清洗含APC 2x的孔，小心吸出孔底部的缓冲液，剧烈冲洗可能会导致APC脱落。
注意：此步骤应谨慎进行，但不要让孔完全干燥。

轻轻地向APC中加入2 ml重悬液的T细胞（1.25 x 10 6 细胞/ ml），并立即置于含有5％CO 2 的37 ° C恒温箱中。将体外T细胞母细胞与APC 孵育90 分钟。爆炸前我们观察到120分钟时APC的T细胞被杀死。对于幼稚T细胞，首先在3 h观察到可测量的吞噬作用，而死于APC的碎片在24 h后会导致假阳性的吞噬作用，因此建议将T另一种是在3-24小时之间使用APC，具体取决于所需的实验设计。
继共孵育，轻轻地涮菜的表面，除去非贴壁细胞，并收集在锥形管。洗涤细胞在10毫升冷PBS PH 7.4 5min，之后离心500 X g ^ 5分钟，弃去上清液对细胞沉淀物进行脉冲涡旋振荡，如果要立即分析细胞，则进行细胞染色。如果要长时间培养细胞，则必须先进行污染性APC的磁耗尽（如程序E中所述）建立文化。

从回收的T细胞中去除APC
在12 x 75聚苯乙烯培养管中，以10 6个细胞/ ml在PBS pH 7.4中从体外光着细胞试验中回收的重悬细胞。
用EasySep TM 磁铁取出含有吞噬细胞的磁珠的APC，将装有细胞的管在磁铁中孵育5分钟，带有磁珠的APC应在磁铁上形成透明沉淀，轻轻将悬浮在PBS中的细胞倒入无菌的15 ml 如果第一次磁分离后T细胞悬浮液中存在可见的含珠APC，则必须重复步骤E2。图1显示了该锥形管的效率，可以使用显微镜快速评估TPC对T细胞的潜在污染。从回收的T细胞中污染APC消耗的方法。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902716--1371 Scott Wetzel 784792 \图jpg \图1.jpg

1.磁性贫身影污染性APC。A.立即恢复后从90分钟。在体外Trogocytosis测定约20 Pasento细胞是污染性APC。B. 后磁性贫，污染了APC补不到0.05 Pasento细胞。

应执行第二次APC去除步骤以去除任何残留的APC。将T细胞培养物以10 5个细胞/ ml重悬于cRPMI中，并将3 ml /孔放入新鲜的6孔板中，或将9 ml置于100 mm组织中-处理后的培养P ETRI菜。
在5％CO 2 的存在下于37 ° C 孵育1小时。
轻轻涡旋培养板以使非粘附性T细胞悬浮，并小心收集培养基，而不会破坏已结合到培养板/孔表面的任何残留APC。
现在培养物中应包含<0.5％的APC，可以通过流式细胞仪对其进行评估。
低密度（10 4 细胞/毫升）重悬T细胞以避免细胞：细胞相互作用，并将2.5毫升/孔放入新鲜的6孔板中。如果观察到培养的T细胞发生显着增殖，则将cRPMI中的细胞稀释至10 4 细胞/毫升，并放入新鲜的孔中。
收集样本以在所需的时间点进行分析。通常，在培养的7-10天之间，绝大多数细胞会死亡，而在培养的10天之后，可能无法检测到生物素化的APC蛋白。

控制项
注意：抗光化细胞物质的中和抗体可用于抑制光化细胞介导的信号转导。由于细胞以低密度培养，未发现中和抗体会增加抗体介导的细胞杀伤或补体介导的裂解。浓度为20μg/毫升已被证明足以阻断光化细胞介导的信号传导，但是应通过滴定确定适当的浓度。可以通过在体外光化细胞测定之前和期间30分钟向APC添加中和抗体来测试，浓度为1 ：5 APC：T细胞比率：可以成功阻止APC信号传导的Ab浓度足以阻止吞噬作用介导的信号传导。

在建立90分钟的体外光化细胞培养之前，先放置2 x 10 6个T细胞（幼稚或T细胞胚细胞），保存在冰上，直到从光化细胞测定法（步骤H3 - H9）中回收的副细胞上被染色，用作未刺激的对照确定T细胞活化标志物和吞噬细胞分子的基线暴露。
刺激T细胞在抗CD3 Tasu抗CD28预包被的平板（小号Tep的B1）在平行于所述体外Trogocytosis测定。恢复恢复从Trogocytosis试验细胞和染色沿边细胞。这些细胞既用作正T细胞活化的阴性对照和光吞作用的阴性对照。

体内光吞作用
Trogocytosis发生在T细胞活化体内（Riond 等，2007;福特麦金太尔等，2008; Rosenits 。等，2010 ）。Trogocytosis Tasu 单元中，发生在体内通过常规免疫野生型（WT）小鼠。

注意：在免疫后28天内已在T细胞上检测到了Trogocytosed分子，但是，可检测到的Trog + 细胞数量最多的可能是在免疫后5-10天内。

在100 µl Sigma佐剂系统（SAS）中用300 µg鸡蛋白清蛋白（OVA）（Sigma-Aldrich）或尾巴皮下免疫野生型小鼠，或使用1 ml注射器将100 µl SAS作为对照。 25 G 针（5/8英寸长）。
14天后皮下注射相同的小鼠，以提供加强疫苗接种。最初的OVA免疫小鼠在100μlPBS中注射300μgOVA，而PBS对照小鼠仅注射100μlPBS。
第二次免疫后五天，从每只小鼠中恢复引流的腹股沟腹股沟淋巴结和脾脏，并准备单细胞悬液用于流式细胞术（步骤s B3和B5）。
像步骤H3 - H9 一样染色细胞并通过流式细胞仪进行分析。
ñ OTES：

为了检测体内产生的trog + 细胞，建议使用针对肌钙蛋白的靶分子和链霉亲和素的生物素化抗体来增强检测。如果要鉴定多个肌钙蛋白的分子，理想的是将针对这些靶的抗体缀合得更亮。荧光团（即，PE-CF594，APC-Cy7的/ 780，或BV421，BV711，BV786）。
TROG Tasu 细胞被鉴定为CD3 Tasu CD4 Tasu CD80 / 86 Tasu IA / E Tasu 。为了限制分析细胞因子和转录因子的表达对细胞具有类似的激励状态，CD4 Tasu CD69 高细胞的门控开启之前识别TROG Tasu 而trog – 人口。

染色细胞通过流式细胞仪分析
在TCR转基因系统中，从体外的细胞吞噬作用恢复后，大约有20-40％的幼稚细胞和30-40％的活化细胞是trog + 。根据观察到的时间点，trog + 的频率，Ag特异性激活CD4 + T的范围为3-20％，而对照细胞（非Ag特异性）的< 1％为trog + 。如果在光吞细胞试验之后进行T细胞的延长体外培养，则应等分细胞马上跟随Trogocytosis-检测，以确定初始频率TROG中Tasu 细胞。
从体外或体内的细胞吞噬作用回收细胞后，在所需的时间点将待分析细胞放入12 x 75 mm聚苯乙烯试管或圆底96孔板的单个细胞中。每10 6个细胞50 µl 流动染色缓冲液。
通过以300-500 x g 的速度旋转细胞5 分钟，以PBS pH 7.4洗涤细胞（对于96孔板为250 µl，如果在试管中则为0.5 ml）洗涤5 分钟。离心后弃去上清液，然后轻轻甩动或快速涡旋以松动沉淀的细胞。
现场稀释/死细胞染色在PBS 将p ^ h 7.4，孵育10分钟，在室温下，在黑暗中。在此孵化，准备染色剂概述的步骤H5下面。
在流动染色缓冲液中稀释所需的抗体染色面板上应包括目标靶细胞（例如CD4）上的标记，以及针对目标人群未表达的感兴趣的吞噬细胞分子的抗体，例如CD80 / CD86，ICOS-L和MHC II类（小鼠）。应对每种抗体进行滴定，以最大程度地增加阳性和阴性群体之间的分离。如果要使用荧光染料偶联的抗生蛋白链菌素检测T细胞上是否存在生物素化的APC衍生分子，则应添加它。抗体染色溶液。
按照步骤H3的步骤洗涤细胞2次。
加入染色鸡尾酒，将细胞在避光的冰上孵育20分钟。
孵育后，与步骤H3一样，在流动染色缓冲液中洗涤细胞2次。
将细胞重悬于300 µl 流动染色缓冲液中，将样品保存在4 °C或冰上，并在2 h内进行分析；或者，将细胞用2-4％的低聚甲醛固定，用PBS pH 7.4稀释，固定30-45分钟。在流染缓冲液中稀释2次，并在黑暗中在4° C下悬浮在大约300μl的流染缓冲液中过夜，第二天进行分析。
注意：如果检查细胞内靶标，则应在染色前用适当的通透试剂针对所需靶标进行表面染色，例如Triton X-100，含皂苷的缓冲液或甲醇，然后进行非永久性透化。如0.1％皂苷，细胞内标记物的染色以及随后的洗涤必须包括通透性试剂，在细胞内染色后，请按照步骤H8进行。

资料分析

分析执行数据使用离线分析软件如的FlowJo。如图˚F Igure 2，识别TROG中Tasu 性T细胞开始由于创作的盖茨隔离淋巴细胞群（SSC-A对FSC-A），其次是严格的双重峰排除（FSC-W vs. FSC-H，SSC-W vs. SSC-A）。排除对活/死染色呈阳性的死细胞，然后分离目标细胞群（即CD3 + 和CD4 Tasu ）。APC如DC和B细胞可进一步排除此时通过附加门，作为Trogocytosed分子通常是至少一到两个日志下的荧光强度相比，APC。

通过存在经细胞吞噬的生物素化APC膜蛋白（大于染色的，抗CD3 / CD28刺激的或未刺激的对照）或存在CD80 / CD86 + MHC II类来鉴定是否存在吞噬作用阳性（trog + ）细胞在所示˚F Igure 3。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902716--1371 Scott Wetzel 784792 \图jpg \图3.jpg

图2.识别体内产生的trog + 细胞的门控策略.A 。在前向散射区（FSC-A）与侧向散射区（SSC-A）图.BD中识别出的淋巴细胞群。SSC和FSC面积和宽度图E. CD3 + 单线态细胞门控，然后F. CD4 + 门控G.用活/死指示剂染色后，然后分析活CD 3 + CD4 + 细胞是否存在HI。盒中的细胞是来自抗原免疫的动物（I）和PBS对照（H ）动物的吞噬作用阳性的CD4 + 细胞。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902716--1371 Scott Wetzel 784792 \ Figs jpg \图2.jpg

3.测量图生物素化的APC膜，以确定TROG Tasu CD4 Tasu 细胞。表面上存在生物素在T细胞之前，立刻AFTE - [R T细胞恢复从A 90闵体外TROG测定。

菜谱

盖伊的解决方案A
35克NH 4 Cl

0.85克KCl

0.595 g永久Na 2 HPO 4

0.12克KH 2 PO 4

5克葡萄糖

50毫克酚红

1升超纯水

无菌过滤器，并在4°C下储存

盖伊溶液B
1克MgCl 2 · 6H 2 O

0.35克MgSO 4 · 7H 2 O

0.85 g CaCl 2 （无水）

250毫升超纯水

无菌过滤器，并在4°C下储存

作者：Gey中小号OlutionÇ
5.63克NaHCO 3

250毫升超纯水

无菌过滤器，并在4°C下储存

1x Gey's低渗溶液（RBC裂解缓冲液）
200毫升溶液A

50毫升溶液B

50毫升溶液C

700毫升超纯水

无菌过滤器，并在4°C下储存

具有Joklik修改（S-MEM）的微调器最小基本中型鹰
1瓶MEM-Joklik

1,000毫升Ultrapure H 2 O

将1瓶（g）溶于800 ml H 2 O的配料中，直至溶解
用NaOH沉淀或10 N HCl 将pH调节至7.0-7.1。添加剩余的水使总体积达到1 L
具有0.22 µm过滤器的无菌过滤器，并在4 °C 的黑暗环境中存储
完整的媒体补充
630毫升S-MEM

7.5克D-葡萄糖

75 ml MEM非必需氨基酸

140ml MEM必需氨基酸

100毫升丙酮酸钠

8.5 克碳酸氢钠3

600毫克青霉素G

中号500 ģ ģ Entamicin 小号Ulfate

克1- 小号Treptomycin 小号Ulfate

Myueru 34 50 MM 贝塔巯基乙醇

搅拌直到溶解的成分（请勿加热）
PH-7.0调整- 。7.1用NaOH粒料或10当量盐酸添加剩余笏ER-，将总体积至1L
具有0.22 µm过滤器的无菌过滤器，并在4 °C 的黑暗环境中存储
完整的RPMI（cRPMI）
1瓶RPMI 1640粉末（不含L-谷氨酰胺或NaHCO 3 ）。

2克碳酸氢钠3

100毫升胎牛血清（佐治亚州弗洛蒂科，亚特兰大生物公司）

100毫升完全培养基补充剂

10毫升100x L-谷氨酰胺

800毫升超纯水H 2 O

将700 ml H 2 O与干净的搅拌棒一起加入2 L烧杯中
在缓慢搅拌水的同时，将装有粉末状介质的空瓶倒入烧杯中
用水冲洗瓶中的所有粉末，然后将其添加到烧杯中
搅拌直至溶解（请勿加热）
添加NaHCO 3 ，L-谷氨酰胺，完全培养基补充剂和FBS
PH-7.0调整- 。7.1用NaOH粒料或10当量盐酸添加剩余笏ER-，将总体积至1L
具有0.22 µm过滤器的无菌过滤器，并在4 °C 的黑暗环境中存储
完整的DMEM（cDMEM）
1瓶RPMI 1640粉末（不含L-谷氨酰胺或NaHCO 3 ）。

1克碳酸氢钠3

100毫升胎牛血清

100毫升完全培养基补充剂

10毫升100x L-谷氨酰胺

800毫升超纯水H 2 O

将700 ml H 2 O 与干净的搅拌棒一起加入2 L烧杯中
在缓慢搅拌水的同时，将装有粉末状介质的空瓶倒入烧杯中
用水冲洗瓶中的所有粉末，然后将其添加到烧杯中
搅拌直至溶解（请勿加热）
添加NaHCO 3 ，L-谷氨酰胺，完全培养基补充剂和FBS
PH-7.0调整- 。7.1用NaOH粒料或10当量盐酸添加剩余笏ER-，将总体积至1L
具有0.22 µm过滤器的无菌过滤器，并在4 °C 的黑暗环境中存储
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）
400克氯化钠

57.3克Na 2 HPO 4

10克氯化钾

10克KH 2 PO 4

5 L 超纯水2 O

溶于5 L超纯H 2 O 中的试剂，并将pH值调节至6.9

1x无菌磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4
100毫升10 PBS

900毫升Ulturapure H 2 O

将100 ml 10x PBS和850 ml Ultrapure H 2 O加入2 L烧杯中
和调节pH拌入到7.0 - 。用NaOH粒料或10当量盐酸7.1其余添加笏ER-，将总体积至1L
具有0.22 µm 过滤器的无菌过滤器，可在室温或4°C下储存
1x无菌磷酸盐缓冲盐水，pH 8.0
100毫升10 PBS

900毫升Ulturapure H 2 O

将100 ml 10 x PBS和850 ml Ultrapure H 2 O加入2 L烧杯中
并搅拌一Djust的pH至7.6 - 7.9用NaOH粒料或10当量盐酸添加剩余的水以使总体积为1 大号
具有0.22 µm 过滤器的无菌过滤器，可在室温或4°C下储存
流式细胞仪染色缓冲液
20 g BSA分数V

10 ml 10％NaN 3 溶液

990毫升1x PBS pH 7.4

将成分添加到乙醚中并搅拌以溶解BSA
溶液溶解后，在4 °C 下避光保存
10％叠氮化钠溶液（NaN 3 ）
10克NaN 3

100 ml 1x PBS，pH 7.4

搅拌下将NaN 3 溶于PBS中，一旦溶解，转移到100 ml瓶中并在室温下保存

4％多聚甲醛
4克低聚甲醛

100 ml 1x PBS，pH 7.4

在100 ml瓶中一起添加多聚甲醛和90 ml BS
在通风橱中，将溶液加热至约50°C，同时搅拌使多聚甲醛溶解，这可能需要30-60分钟
混浊的溶液变澄清后，从火上移开并添加剩余的PBS
存放于4°C避光处，长达1个月

致谢

由R03AI122167和蒙大拿大学小额赠款计划（SAW）资助的工作。用于进行研究的荧光细胞计数法，分子组织学和荧光成像核心设施得到P30RR033379的支持。此处概述的协议最初是由Wetzel实验室的几篇论文（Wetzel et al。，2005; Osborne and Wetzel，2012; Reed and Wetzel，2019 ）。

竞争利益

对于作者而言，没有金融和非金融方面的竞争利益。

道德规范

程序是监督所有，并根据大学的蒙大拿州机构动物护理和使用委员会根据协议069-17，这是主动12/17 - 12/20 。

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