材料和试剂

1. 1.5ml试管（沃森，目录号的：131-815C）

2. 2毫升管（沃森，目录号的：132-620C）

3. 6孔细胞培养板（Violamo ，目录号：2-8588-01）

4. 96孔细胞培养板（Violamo ，目录号：2-8588-05）

5. 14×95毫米开顶Polyclear 离心管（西顿科学，目录编号：7031）

6. 白色的384孔免疫板（Thermo ，目录号：460372）

7. 0.22 Myuemu 过滤器（默克密理博，目录号：UFC30GV00）

8. 293T细胞（ATCC ，目录号：CRL-3216）

9. Huh7细胞（JCRB ，目录号：JCRB0403）

10. 质粒PCAG -JEC-FLAG- HiBiT 编码HiBiT -标记的野生型JEV C蛋白（石田等人，2019;可从作者根据要求）ö ř及其变体编码突变晶型C蛋白的

11. 编码JEV prM 和E蛋白的质粒pCAG-prME （Suzuki 等，2014；应要求可从作者处获得）

12. 质粒PCMV-JErep-Nluc 其表达Subgeno 麦克风复制子RNA的JEV，其中包含一个NanoLuc 报道基因（松田等人，2018年，石田等人，2019;可从作者根据要求）

13. Nano Glo HiBiT 裂解检测系统（Promega，目录号：N3040）

14. Nano-Glo荧光素酶测定系统（Promega ，目录号：N1120）

15. Dulbecco改良的Eagle媒体（Nacalai ，目录号：08458-16）

16. FBS（胎牛血清）（Thermo，目录号：10270-106）

17. PBS（磷酸盐缓冲液不含钙和镁）（ナ，目录号：14249-24）

18. 苄青霉素钾（Fujifilm，目录号：021-07732）

19. 硫酸链霉素（Tokyo Chemical Indus try，目录号：S0585）

20. PEI MAX（PolyScience产品，目录号：24765-1），转染试剂

21. Opti-MEM（Thermo，目录号：31985062），减少的血清培养基，可保持较高的转染效率，且细胞毒性较小

22. 蔗糖，离心密度梯度等级（Nacalai ，目录号：30406-25）

23. Tris （Tris（羟甲基）氨基甲烷）（Nacalai ，目录号：35406-91）

24. NaCl （Nacalai ，目录号：31320-05）

25. Triton X-100（Nacalai ，目录号：35501-15）

26. KCl （Nacalai ，目录号：28513-85）

27. 娜2 HPO 4 （ナ，目录号码：31726-05）

28. KH 2 PO 4 （Nacalai ，目录号：28720-65）

29. PEI溶液（1毫克/毫升）（请参阅食谱）

30. 100x青霉素G +链霉素原液（请参阅食谱）

31. 文化媒体（请参阅食谱）

32. 10X PBS（pH 7.4）中（见配方）

33. 10％蔗糖/ PBS（请参阅食谱）

34. 45％蔗糖/ PBS（请参阅食谱）

35. 10-45％蔗糖线性梯度/ PBS（请参阅食谱）

36. 裂解缓冲液（请参见食谱）

配套设备

加湿培养箱（PH CBI，型号：MCO-170AICUVD-PJ，37°C，5％CO 2 ）
超速离心机（日立，型号：CP80NX）
摆斗式转子（日立，型号：P40ST）
梯度混合器（BIOCOMP，梯度配合）
活塞梯度分馏仪（BIOCOMP，目录号：153）
微孔板光度计（Thermo ，Varioskan LUX多模式微孔板读取器）
-30 °C冷冻室（PHCBI，目录号：MDF-MU539D）
程序

以下过程的流程如图2所示。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902991--1375森田英治812018 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

˚F Igure 2.流量程序

含HiBiT 的颗粒的生产
将293T细胞接种到6孔板中，并在2 ml生长培养基中以〜50,000个细胞/孔的密度接种。
将板放在CO 2 培养箱中24小时。
0.2 Myug混合PCAG -JEC- HiBiT ，0.4 Myug PCMV-JErep-Nluc 和0.2 Myug PCAG-JEprME 在200 Myueru的Opti-MEM，拌匀用涡旋搅拌机。
（可选）小号的Et控制实验使用空载体代替每种质粒。

（可选）小号的Et实验使用的质粒编码突变形式的病毒元件兴趣。

向混合物中加入2.4 µl PEI溶液（1 mg / ml），并用涡旋混合器充分混合。
在室温下将DNA-PEI混合物孵育15分钟。
将DNA-PEI混合物施加到含细胞的孔中（〜200μl / 孔）。
将板放在CO 2 培养箱中。
转染后6小时补充生长培养基。
注意：将培养基缓慢加入孔的侧面，以避免细胞分离。

转染后48小时补充生长培养基。
注意：将培养基缓慢加入孔的侧面，以避免细胞分离。

转染后72小时将培养上清液转移至2 ml管中。
在20,000 xg ，4 °C下离心10分钟。
将吸管转移到新鲜的试管中，然后进行步骤B或步骤C。

评估SRIPs产生细胞中亚基因组复制子RNA 的复制效率（典型结果如图2A所示）。
将每个孔中的细胞悬浮于1 ml PBS中，并转移至1.5 ml管中。
将离心管在2,400 xg ，4°C下离心5分钟。
吸出补品，添加50μl 裂解缓冲液并通过移液混合。
在20,000 xg ，4°C下离心10分钟。
5传输Myueru 的澄清的裂解每管384 - 孔板。
加入5μl 用裂解液以1：600稀释的NanoLuc 底物。
在室温下孵育10分钟。
使用酶标仪测量发光。

培养上清液中SRIP的滴定（典型结果如图2C所示）。
将Huh7细胞以〜10,000个细胞/孔的密度播种到96孔板中，并在CO 2 培养箱中孵育过夜。
在每个孔中接种100μl 培养上清液（用步骤B制备）。
孵育72小时。
吸出生长培养基，向每个孔中加入50μl 裂解缓冲液，然后通过移液混合。
将每个孔中的5μl 裂解物转移到384孔板中。
加入5 µl 用裂解缓冲液稀释为1：600 的NanoLuc 底物。
在室温下孵育10分钟。
使用酶标仪测量发光。

培养液的蔗糖密度梯度离心
第3层00 Myueru 的培养上清含HiBiT 标记的颗粒在连续10-45 Pasento蔗糖梯度/ PBS在开顶Polyclear 离心管（SETON，14 X 95 毫米）。
使用预冷的回转铲斗转子在4 °C下以100,000 xg 的速度离心3小时。
梯度从分馏从上到下（总计< 40分），与活塞分馏（2.3毫米/级分，0.3毫米/秒）到96 - 孔平板中。

沉淀级分中含C- HiBiT 的颗粒的滴定（典型结果如图2B所示）。
5传输Myueru 的分数在每个孔中以384 - 孔板。
5加入Myueru 中HiBiT 试剂，每孔。
在室温下孵育10分钟。
使用酶标仪测量发光度.3>实验中的典型结果显示在图中。

沉淀物中SRIP的滴定（典型结果如图2D所示）。
将Huh7细胞以〜10,000个细胞/孔的密度播种到96孔板中，并在CO 2 培养箱中孵育过夜。
在每个孔中接种5μl 沉淀级分。
孵育72小时。
吸出生长培养基，向每个孔中加入50μl 裂解缓冲液，然后通过移液混合。
5传输Myueru 裂解液中。每孔384 - 孔板。
加入5μl 用裂解缓冲液稀释600倍的NanoLuc 底物。
在室温下孵育10分钟。
发光使用测量微孔板读尔（图3）。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902991--1375森田英治812018 \ Figs jpg \ Fig3.jpg

3.典型的结果图。（A）NanoLuc 活性的生产细胞裂解物，以评估中自主复制的亚基因组RNA（B）HiBiT 活动馏分的生产细胞培养物上清液，分馏通过蔗糖密度梯度离心。（C）NanoLuc 活性的目标（D）用生产者细胞上清液的蔗糖密度梯度离心分离级分接种的靶细胞的NanoLuc 活性，其反映了级分中SRIP的感染性滴度。

注意事项

NanoLuc / HiBiT 系统发出的强发光有时会泄漏到384 孔板的相邻孔中，因此建议将样品加载到其他每个孔中，此外，有时最好稀释能产生强信号的裂解物或馏分以将其最小化发光泄漏到邻近的孔（过程B，D，E和F）。
请注意，在滴定级分中的HiBiT -SRIPs 滴定时，很难估算顶部级分中C- HiBiT的相对含量（步骤B），因为从级分中的细胞泄漏的游离NanoLuc 蛋白也有助于信号产生。

菜谱

PEI溶液（1 毫克/毫升）
PEI最大100毫克

ddH 2 O 高达100 ml

通过A 0.22灭菌器Myuemu 过滤，分装至15ml管中并保持管作为工作原液在冰箱中，其余的管子在一个-30 ℃的冰箱中

100x青霉素G +链霉素原液
PBS 100毫升

苄青霉素钾0.626克

硫酸链霉素1克

通过0.22灭菌器Myuemu 费尔之三和储存在冰箱

文化媒体
Dulbecco改良的Eagle培养基500毫升

FBS，通过在56°C下孵育45分钟50 ml 进行热灭活

100x青霉素G +链霉素原液5毫升

10x PBS（pH 7.4）
氯化钠80克

氯化钾2.0克

Na 2 HPO 4 14.4克

KH 2 PO 4 2.4克

ddH 2 O 至1 L

10％蔗糖/ PBS
蔗糖100克

10x PBS 100毫升

ddH 2 O 至1 L

通过0.22灭菌器Myuemu 过滤接- R和室温保存

45％蔗糖/ PBS
蔗糖450克

10x PBS 100毫升

ddH 2 O 至1 L

通过0.22灭菌器Myuemu 过滤接- R和室温保存

1 0 -45 Pasento SUCRO 硒线性渐变/ PB 小号
将适量的10％蔗糖/ PBS倒入14 x 95 mm敞开式多透明离心管中，使用针头注射器在管的底部覆盖45％蔗糖/ PBS，使用具有以下参数的梯度形成剂形成线性梯度：

时间：2分钟5 s

甲Ngle：82 °

小号皮德：16的rpm

形成梯度后，将其在4°C放置几小时以使其冷却

裂解缓冲液
1 M Tris pH 7.5 20毫升

5 M氯化钠30毫升

海卫一X-100 10.7克

ddH 2 O 至1 L

致谢

谢谢我们嘉汇翁校对手稿。我们感谢松田麻美为有用的意见和建议，制定HiBiT -SRIP系统。

竞争利益

作者没有与本文内容直接相关的竞争利益。

[R Eferences

Chambers，TJ，Hahn，CS，Galler，R。和Rice，CM（1990），黄病毒基因组的组织，表达和复制， Annu Rev Microbiol 44：649-688。
Ishida，K.，Goto，S.，Ishimura，M.，Amanuma，M.，Hara，Y.，Suzuki，R.，Katoh，K. and Morita，E.（2019）。日本人亚细胞定位之间的功能相关性脑炎病毒衣壳蛋白和病毒生产，《病毒学杂志》93（19）。
松田（Matsuda），山中（Yamanaka），安藤（Yato），吉井（Yoshii），渡边（Washi），K.Aizaki，H。，小西（Konishi），高崎（T.），加藤（T.），村松（M.）， Wakita，T.和Suzuki，R.（2018）。使用登革热1型报告基因复制子，基于单轮感染颗粒对多种黄病毒进行高通量中和测定。科学报告8（1）：16624。
R. Suzuki，R. Ishikawa，T. Konishi，E.，Matsuda，M.，Watashi，K.，Aizaki，H.，Takasaki，T.和Wakita，T.（2014）。单轮传染性嵌合体的生产。带有基于DNA的日本脑炎病毒复制子的黄病毒， J Gen Virol 95（Pt 1）：60-65。