材料和试剂

Labelin实验室摹胶带
一次性Kontes ® 颗粒杵® 磨床（VWR，目录编号：KT749520-0000）
康宁® 0.2 MYU 中号注射器过滤器（Sigma-Aldrich公司，目录编号：CLS431215）
15个中号大号猎鹰管（费舍尔，目录编号：14-959-49B）
50个中号大号猎鹰管（费舍尔，目录号：14-432-22）
1.5 中号大号微量管（FISHERBRAND TM ，产品编号：05-408-129）
称量船（Fisherbrand TM ，目录号：08-732-112）
吸取技巧（费舍尔，目录编号：02-707-401，02-707-415，02-707-436）
MM-90 皮氏培养皿（Nunc公司® ，目录编号：Z717223-320EA）
显微镜载玻片（Fisher，目录号：12-518-100B）
22 x 22 显微镜幻灯片盖玻片（VWR，目录号：470145-876）
巴斯德玻璃移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-20A）
塑料一次性刻度移液器（Fisherbrand TM ，目录号：13-711-9BM）
硼硅玻璃一次性日ML ESS 文化管（托马斯科学，目录编号：99445-10）
C. 线虫菌株; 对于野生型使用布里斯托尔N2 应变从线虫遗传中心（CGC）
E. 大肠杆菌OP50 和OP50-GFP 可以被获得从该CGC （Https://Cgc.Umn.Edu/）
沙门氏菌MST1-GFP可根据要求提供
甘油 ≥ 99.5 Pasento（Sigma-Aldrich公司，目录号：G9012 ）
NaCl （Merkmillipore ，目录号106404）
BD Bacto TM 蛋白ept （Fisher，目录号：S71604）
Gibco TM Bacto TM 胰蛋白（（Fisher，目录号：DF0123-17-3）
硫酸链霉素（Thermo Fis her Scientific，目录号：11860038）
硫酸庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G4918）
氨苄西林还原碱（西格玛奥德里奇，目录号：A9393）
BD Bacto TM 琼脂（VWR，目录号：90000-760）
CaCl 2 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C75209）
乙醇纯度≥99.5％（Sigma-Aldrich，目录号：459836）
盐酸左旋咪唑≥99 ％（Sigma-Aldrich，目录号：1359302）
K 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：RES20765）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：1551139）
MgSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：230391）
酵母提取物（Gibco TM ，目录号：212710）
线虫生长培养基（NGM）板（请参阅食谱）
固体Luria-Bertani（LB）（请参阅食谱）
液体LB（请参阅食谱）
无菌1 M MgSO 4 溶液（请参见配方）
无菌1 M CaCl 2 （请参阅食谱）
无菌磷酸盐缓冲液（请参见食谱）
M9缓冲区（请参阅食谱）
M9中的左旋咪唑250 mM（库存）（请参阅食谱）
M9 + Lev（具有25 mM左旋咪唑的M9）（请参阅食谱）
M9 + Lev + Ab（M25，含25 mM左旋咪唑和抗生素）（请参阅食谱）
1 mM左旋咪唑用于显微镜检查（请参见食谱）
87％的甘油用于细菌储备（请参阅食谱）
显微镜中每加仑2 ％的显微镜（请参阅食谱）

配套设备

手动理货计数器（Humboldt，货号：H-9700）
Pipetman P10，P200 P1000 （Gilson，目录号s：F144802，F123601，F123602）
铂拾取制造如描述在Wollenberg 的Et 的Al 。（2013）
本生燃烧器
高压釜
搅拌炉
散热块
冷冻离心机（Eppendorf）
层流柜
孵化器对于稳定的温度
孵化器对于液体文化
用荧光解剖立体镜
冷冻室（-20 °C ）
毫升ģ500 大号驴乙埃克
0.5 和1 大号DURAN ® 原始玻璃瓶（Www.Duran-bottle-system.Com）
搅拌器
我Nverted荧光显微镜X40 X60和放大倍率，并且利用Nomarski 过滤器（尼康，型号：Eclipse中的Ti-5）
软体类

斐济（Schindelin 等人，2012）（斐济我小号Ĵ 乌斯ImageJ的）版本2.0 ，甲Vailable在Http://Imagej.Net（斐济/下载）
微软® Excel的2015年
图P 广告棱镜6 （© 的GraphPad 软件）

程序

注意：所有微生物技术均应在本生灯旁边的干净工作台中进行。

细菌和线虫生长
分别存储在细菌50个Pasento甘油储在-20 ℃下。股通过混合287 Myueru 无菌87 Pasento甘油和213 Myueru 培养细菌。通过混合反演。
将甘油储备液中的大肠杆菌OP50-GFP和鼠伤寒沙门氏菌MST1-GFP分别涂在单个Luria-Bertani（LB）平板上，并在37 °C下过夜培养。这两种细菌的LB 平板应含有氨苄青霉素（50μg / ml ）。
第二天，挑取单克隆，成长它在-10 M 大号液体LB补充有50 Myug / M 大号氨苄青霉素在37 ℃下6小时上的50男大号Falcon管。该OD 600 应为1.5至2。可用200μl 无菌木偶尖端或涂片环（用火灭菌）挑出菌落。管盖应松动，但要用实验室胶带固定。以200 rpm摇动。
3号种子中号大号的每个细菌培养走上90毫米NGM琼脂平板上。晾干，并用它们第二天。保持室温。
5个L4蠕虫接（感兴趣的遗传背景），进入接种每个板大肠杆菌OP50-GFP和S. 鼠伤寒沙门氏菌MST1-GFP。实验应进行一式三份。
让蠕虫生长到所需的发育阶段（图1）。在我们的案例中，我们允许蠕虫生长2天，并选择在每个细菌性草坪上生长的L4，因为它很容易识别为特定的发育阶段。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902780--1357 Andrea Calixto 566311 \图jpg \图1.jpg

图1 野生型（N2）蠕虫生长在E. 大肠杆菌OP50 和沙门氏菌鼠伤寒MST1。正如以前描述的（Palominos 的Et 的Al 。，2017），所述的曝光要细菌病原体对于两个连续世代原因即甲百分比中C. 线虫种群进入滞育，形成的的Dauer 幼虫（箭头）。大人可以被看在这两个条件（箭头）。刻度条= 500 MYU 中号。

隔离细菌从C. elegans的肠子：同质化和串行稀释
注：该程序是否应被携带出在一个无菌的。面积在理想情况下，在一个层流流。内阁所有的解决方案应该是蒸压先用。

在M9溶液（M9 + Lev）中准备左旋咪唑（25 mM），这将使蠕虫瘫痪并停止咽部抽吸，避免溶液进入蠕虫的内部。
30蠕虫选择所需的阶段生长在每种细菌草坪，并通过他们与铂选择走上1.5 中号大号离心管中含1 中号大号中中号9Tasu 列弗。三管是否应被准备每细菌随着禾RMS公司根据每个副本（步骤A4）这将是1号生物学副本（2号和3号副本应在不同的日期进行）。
蠕虫对于2型离心机分钟，在376 X g ^ 。弃上清。
填写随着1 中号大号中M9 Tasu 列弗。
重复步骤B 3 -B 4 两次。
丢弃M9 Tasu列夫而重悬蠕虫在1 中号大号中M9 Tasu 列夫加味随着抗生素（M9 Tasu 列夫Tasu Ab）的。
重复步骤S B 3 -B 5，但随着M9 Tasu 列弗Tasu AB，而是中M9 Tasu 列弗。
弃上清，重悬包衣种蠕虫在1 中号大号中M9 Tasu 利Tasu 抗体和孵育为一个小时。
重复步骤B 3 -B 5。
注意：仅使用M9 + Lev。

放弃M9 Tasu 列弗由于大部分作为可能与裂解蠕虫有了一个无菌杵（可能是电动如果可用）。
注意：每个试管上的蠕虫都应该用无菌杵溶解，将蠕虫溶解1分钟，或者直到蠕虫沉淀完全溶解为止。

裂解的蠕虫重悬于500 Myueru 中M9。
注意：连续稀释液由一系列连续测量的稀释液组成，这些稀释液的制备是为了降低细菌的浓度并获得每个样品已知数量的菌落形成单位。

1:10蠕虫稀释裂解物，在七个连续稀释液（稀释＃1至＃7）在M9。例如采取的1M 大号虫溶胞产物进入-9 M 大号中M9缓冲液中。这将是稀释＃1。然后，的1M采取大号的稀释＃1向-9 M 大号中M9缓冲液，制作稀释＃2.重复到顺序稀释＃7。
取200μl ＃5（10 -5 ），＃6（10 -6 ）和＃7（10 -7 ）稀释液，并将其接种在含抗生素的固体LB上。链霉素用于选择大肠杆菌OP50，氨苄青霉素用于筛选荧光性鼠伤寒沙门氏菌MST1-GFP和大肠杆菌OP50-GFP 菌株。
孵育平板过夜。在37 ℃下。

量化中细菌定植通过计算菌落形成单位（CFU）在C. elegans的肠（或者简单的电镀）
注意事项：

第二天，检查是否有不希望的细菌或真菌污染，以确保您可以计数所报告形态的细菌菌落，例如，大肠杆菌OP50菌落很小，呈圆形，乳白色，边界清晰。有光泽，中心和圆形边缘密集。
将有9个您板分离的菌落从每个细菌，在这种情况下，18块板共（3大肠杆菌重复，其他三个重复沙门氏菌，每每10 -5 ，10 -6 ，10 -7 稀释）。

计数的号码中的菌落用一个手理货计数器（洪堡）。数字计数器，或者基于图像的计数器可以同时被使用。
注册的每个值在一个MS ® 的Excel 工作表。
使用以下公式计算每个蠕虫的CFU ：

定量中的等级中细菌定植在该肠道使用荧光显微镜
准备琼脂垫作为描述由莫妮卡·德里斯科尔（Www.Wormatlas.Org/agarpad.Htm）或者在WormBook 。相反中一个5 Pasento 琼脂解决方案，我们用2 Pasento。
选择15个蠕虫每细菌条件要个别琼脂垫含一降中1 MM 左旋咪唑盐酸盐使用一个白金选择。小金额中橡皮泥的可以被放置在每个角落中一个22 X 22 盖玻片之前覆盖的准备为了避免施压的蠕虫。
分类蠕虫根据要在存在中GFP 阳性细菌在他们的胆量。作为描述在Palominos 的Et 铝。（2017年），蠕虫利用无检测的荧光或者分立细菌在该咽部是否分类为“未检出”（图2A“）。蠕虫利用当在整个肠道中发现有GFP标记的细菌时，有荧光细菌的肠道的三分之一将被分类为“部分”和“完全”（图2B'）。
进行量化的号码中动物用不同的表型。保存原始数据。
以代表图像中的每个表型。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902780--1357 Andrea Calixto 566311 \图jpg \图2.jpg

图2. 肠道定殖中C. 线虫肠通过荧光细菌。A-A“ L4 野生型蠕虫生长在E. 大肠杆菌OP50-GFP。大多数蠕虫在这些细菌具有只是散乱细菌在该咽磨床。B-B” 。L4 野生型蠕虫生长在沙门氏伤寒MST1-GFP。蠕虫美联储在沙门氏菌呈现“满”的殖民化的表型，显示个别及蝌蚪GFP阳性菌（箭头）沿着肠道。此外，肠管扩张可以观察（箭头）。比例尺小号= 50 MYU中号。

资料分析

每个实验应该是完成在最三国时代（生物副本，独立的实验完成在不同天）而在一式三份（三样在每一个副本）。参见Palominos 的Et 铝，2017年，材料和方法对于更多的信息。每个生物复制威尔是该数值的价值相应要的平均中的三一式三份。
一个方式中绘制的结果，是通过使用分组列在棱镜6 软件（的GraphPad）。每一列是该平均中一生物的复制品。
对于CFU 计算，使用不配对t 检验分析，具有0.05的显着性（图3A）。
对于小肠定植，使用双向方差分析，Holm - Sidak 检验，显着性为0.05 （图3B）。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902780--1357 Andrea Calixto 566311 \图jpg \图3.jpg

图3. 两种不同的试验要进行量化肠道定植通过细菌在秀丽隐杆线虫。一。菌落形成单位（CFU）每虫生长在E. 大肠杆菌OP50 （白色）和沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌MST1 （红色）对于两个世代。不成牛逼- 测试，P < 0.0001 ... N = 90个蠕虫生物每副本，每一列都包含三个重复。B.显示不同的表型肠道定殖百分比L4蠕虫当生长在大肠杆菌OP50-GFP和S. 鼠伤寒 MST1-GFP。完全，部分而检测不到被定义在步骤d 。Ť 禾路ANOV A，Holm- Sidak 检验，P < 0.05。Ñ = 45个蠕虫每生物副本。

注意事项

蠕虫选择对于CFU 分析应该要健康。避免真菌或者其他类中的污染前开始的实验。
所有的解决方案和容器应成为不育。
肠定植测定可以是完成使用60个毫米塑料培养皿接种的随着150 MYU 大号中细菌培养（步骤A）。
始终选择蠕虫在的同一发展阶段。
高压灭菌的塑料杵，如果不是无菌的。

菜谱

线虫生长培养基（NGM）板
添加在下面要一个1 大号小号Ç HOTT 瓶
3 克氯化钠

2.5 克Bacto Peptona

17 克Bacto 琼脂

双蒸馏水（928 中号大号）

搅拌棒
高压灭菌对于20 敏在121 °C
放置在搅拌盘，等待直到冷却在大约55 ℃，
添加的关注
1 中号大号中1 中号的CaCl 2 无菌

1 中号大号1米用MgSO 4 无菌

25 米升的1M KH的2 PO 4 pH 6.0的无菌

1 中号大号为5mg / 中号大号胆固醇（制备95 Pasento乙醇，并储存在RT）

倒入层流柜中的90 mm无菌板上
干一晚
用适当的细菌接种，或储存在4 °C
固体卢里亚·贝塔尼（LB）
将15g溶解细菌用琼脂，10克细菌用胰蛋白胨，10克NaCl和5克酵母提取物在1000 中号大号DH 2 ö
在121 °C下高压灭菌20分钟
它轻轻漩涡分发琼脂融化均匀地通过溶液。小心！过热液体五月煮沸过当旋涡
一旦冷却-to 55 ℃下该加载抗生素在50 毫克/ 米升（氨苄青霉素和链霉素）的
旋流避免气泡
设置最多一个颜色/标志代码（例如，两个红色线为LB-链霉素，两个黑色线为LB-氨苄青霉素板）
倒入大约30-35 中号大号每板
当介质完全硬化后，将其倒置并储存在4 °C 直至需要
板对于存储删除1-2 ^ h 之前使用他们
液体磅
溶解10 ģ 中细菌用胰蛋白胨，10 ģ 中的NaCl 和5 ģ 中酵母提取物在1 ，000 中号大号
在121 °C下高压灭菌20 分钟
一旦冷却-to 55 ℃下该加载抗生素在50 毫克/ 米升（氨苄青霉素和链霉素）的
无菌1 M MgSO 4 溶液
123.24克硫酸镁的溶解4 ·7H 2 ö500 米升PUR的ë 英里升的iQ 水
在121 °C下高压灭菌20 分钟
室温保存
无菌1 M CaCl 2
5.55克溶解的CaCl 2 失水50男大号中英里大号IQ 水
高压釜
存放在RT
无菌磷酸盐缓冲液
10.7克溶解ķ 2 HPO 4 和32.5克KH 2 PO 4 至300μm 大号中英里大号IQ W¯¯ 亚特
调节pH至6.0
高压釜
存放在RT
M9缓冲
溶解下面以1升纯净军用大号智商水
3克KH 2 PO 4

6克Na 2 HPO 4

5克氯化钠

在高压釜121 ℃下20分钟，然后加载1米升体的消毒的1M硫酸镁4 溶液
存放在RT
注：Ø 笔就在旁边的火焰，在无菌罩，带手套，以最快的速度可能。

M9中的左旋咪唑250 mM（库存）
9.03克混合盐酸左旋咪唑在15 中号大号无菌M9
必要时搅拌
在1个装中号大号微量离心管
保持在-20 °C。避免重新融化
M9 + Lev（具有25 mM左旋咪唑的M9）
混合5 中号大号中250 MM 左旋咪唑库存解决方案随着45 中号大号中无菌M9
保持它在冰上
M9 + Lev + Ab（M9含25 mM左旋咪唑和抗生素）
5准备中号大号中庆大霉素氨苄青霉素库存溶液（10mg / 中号大号通过溶解50毫克庆大霉素和50mg氨苄青霉素在5）中号大号中英里大号IQ W¯¯ 亚特。
用0.2筛选亩中号注射器过滤器，保持在冰上的直至完成等分。储存于-20 ℃下
2000使用MYU 大号的股票根放大器（为10mg / 中号大号），混合随着18 中号大号中M9 Tasu 利，保持在冰上直到使用
1 mM左旋咪唑用于显微镜检查
40混合MYU 大号中M9 Tasu列夫随着960 MYU 大号中M9
用0.2筛选MYU 中号针筒过滤器
储存在4 °C .使用时请放在冰上
细菌库存的87％甘油
8.7米混合大号100 Pasento甘油在1.3M的大号中中号IlliQ 水
高压釜
存放在室温下，光线充足
显微镜中的2％的Gar
3准备中号大号5 Pasento琼脂/ M9 在5米大号玻璃培养管
的玻璃培养地方管2 Pasento阿加玫瑰内部500 中号大号玻璃烧杯，用150-200 中号大号中RT娲泰尔（如仿水浴）
微波60 s作为中等效力
注：ç ..哎呀均匀的混合重悬采用塑料吸管如有必要，可以确保琼脂糖完全融化要到前下一步。

在制作垫子之前，在加热块或浴中将2％琼脂在60 °C下保持
使用后，将其存放在4 °C
致谢

这个工作已经蜜蜂ñ 改编自Palominos 的Et 铝。（2017）。有些蠕虫病毒株是提供通过该CGC，这是资助由美国国立卫生研究院办公室中研究基础设施项目（P40OD010440）的发展中的协议当时资助通过科技基金1120209 为F. PC; 科技基金1131038，CONICYT 智利-USA 2013-0041，而在千年倡议要。交流的炫酷Interdisciplinario 德Neurociencia 德瓦尔帕莱索是一个千年研究所支持通过的千年科学倡议中的智利卫生部中经济发展，而旅游（P029 -022-F）。

竞争利益

该作者声明他们有没有财务权益。

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