材料和试剂

中号BD Icro- 精细TM 加0.5毫升30 ģ胰岛素注射器（BD，目录号码：230-45094）
无菌注射器3 ml，鲁尔锁（MedHarmony ，目录号181110）
Monoject TM 18 G钝插管（Covidien，目录号：8881202348）
孔径为70 µm的细胞过滤器（SPL，目录号：93070）
5 ml带有细胞过滤器盖的聚苯乙烯圆底管（Falcon，目录号：352235）
8 - 周龄C57BL / 6野生型小鼠（Envigo ）
5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU ）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ，目录号：E10187）
牛血清白蛋白（BSA），馏分V（MP，目录号：160069）
Click- iT TM Plus EdU Alexa FluorTM 647流式细胞分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ，货号：C10634）
TruStain FcX TM （抗小鼠CD16 / 32）抗体（Biolegend ，克隆：93，目录号：101319）
V500抗小鼠B220（CD45R）抗体（BD，克隆：RA3-6B2，目录号：561226）
亮紫色605抗小鼠CD138（Syndecan-1）抗体（Biolegend ，克隆：281-2，目录号：142515）
PE-Cy7抗小鼠CD95（FAS）抗体（BD，克隆e：Jo2，目录号：557653）
Alexa Fluor 700抗小鼠CD38抗体（eBioscience by Thermo Fisher Scientific，克隆：90，目录号：56-0381-82）
生物素抗小鼠IgA抗体（Biolegend ，克隆：RMA-1，目录号：407003）。用链霉亲和素APC-Alexa面粉780检测（eBioscience ，Thermo Fisher Scientific，目录号：47-4317-82）
亮紫色421抗小鼠CD196（CCR6）抗体（BD，克隆：140706，目录号：564736）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Biological Industries，目录号：02-023-1A）
1％BSA PBS （请参阅食谱）
EdU 解决方案（请参阅配方）

配套设备

干乙阿特我Ncubator
Analitical 乙Alance
摇摆小号Haker
弯剪（FST，目录号：14091-09）
CytoFlex 流式细胞仪（贝克曼库尔特公司）

软体类

FlowJo 软件（LLC）

程序

注意：缓冲液应在实验当天新鲜配制：

点击- 1X IT ® 的EdU 破膜和清洗试剂稀释用去离子水。
点击- IT ® 的EdU 缓冲添加剂等分应保存在-20 C°和稀释后只有之前准备的反应鸡尾酒用去离子水。
该方案中使用的小鼠为8-10周大，平均体重约为25 g。
所有动物实验均应在获得足够道德规范的批准下进行。
该方案用于测量Peyer斑块内的B细胞增殖，但也适用于其他淋巴结和脾脏。

通过C57BL / 6只野生型小鼠的眶后窦静脉注射200 µl EdU （2 mg）。
施用EdU后2.5小时，通过颈脱位法处死小鼠。
打开腹腔，将盲肠的小肠移至胃中。
使用带有18 G Monoject TM 钝管的30 ml注射器用40 ml PBS冲洗肠道，避免组织与冲洗出的肠内容物接触。
使用弯曲的剪刀朝上，切下Peyer的贴片，并避免切除邻近的肠组织（每只小鼠大约需要6-10个Peyer的贴片，所有Peyer的贴片中总共有3-10百万个细胞）。
将PPs置于带有70 µm细胞过滤器和3 ml 1％BSA PBS的培养皿中。
使用3 毫升注射器的手枪将PP捣碎，以产生PP衍生细胞的单细胞悬液。
将细胞悬液转移到带有细胞滤网盖的FACS管中。
用另外的1 ml 1％BSA PBS缓冲液洗涤培养皿，并将溶液收集到同一FACS管中以最大程度地收集细胞。
在4°C下以300 RCF旋转细胞7分钟。
丢弃上清液，并用残留的缓冲液（约100 µl）重悬细胞。
加入1 µl Fc阻断剂抗体（TruStain FcX TM ，CD16 / 32），涡旋并置于冰上。
在冰上孵育5分钟。
新增100 Myueru染色混合准备在1 Pasento BSA PBS如果扩散应分析在B细胞车厢，由于在相关的研究，下面的标记可用于：生发中心（B220 Tasu CD138 - FAS Tasu CD38 - ）;上皮下圆顶（B220 Tasu CD138 - IgA的Tasu CD38 Tasu CCR6 Tasu ）和等离子体试管室（CD138 Tasu 。）作为阴性对照，我们评估的EdU 以纳入普通B细胞车厢（B220 Tasu CD138 - CD38 Tasu FAS - ）。由于阻塞后管中的剩余体积约为100 MYU大号，抗体混合物被制备为2X浓度，以实现最终稀释所指示。在Ť Abl的ë 1 。

牛逼能1. 名单抗体用于表面染色的GC和SED B细胞

记号笔

最终稀释

原料浓度[mg / ml]

MYU ģ / 100 MYU 大号混合物（2X）

AF488 B220

1：400

0.5

0.25

BV605 CD138

1：400

0.1

0.05

PE \ Cy7 FAS

1：600

0.2

0.067

AF700 CD38

1：600

0.2

0.067

BV421 CCR6

1：200

0.2

0.2

抗体

1：200

0.2

0.2

涡旋并在黑暗中于冰上孵育30分钟，以使表面标记物染色。
用2 ml 1％BSA PBS洗涤细胞，并在300 RCF和4°C下旋转细胞7分钟。
用100 µl Click- iT TM 固定剂（PBS中4％的低聚甲醛）重悬细胞。
在室温下于黑暗中孵育15分钟。
加入3 ml 1％BSA PBS，并在300 RCF和4°C下旋转细胞7分钟。
上清并丢弃悬浮细胞随着100 Myueru 1X卡嗒IT ® 的EdU 破膜和清洗试剂。
用移液器充分混合，请勿涡旋。
在室温下于黑暗中孵育15分钟。
该准备点进IT TM 加反应鸡尾酒根据TABL ë 2 。

表2 。点击- IT TM 加反应鸡尾酒

反应成分

样品数

1个

PBS

438微升

铜保护剂，100 mM水溶液

10微升

Alexa Fluor 647 吡啶甲基叠氮化物;在DMSO中

2.5微升

1X Click- iT TM EdU 缓冲添加剂

50微升

总反应体积（微升）

500微升

重要说明：

在步骤22中准备鸡尾酒。
按照表中列出的顺序添加反应组分。
准备鸡尾酒后15分钟内使用鸡尾酒。
保持鸡尾酒在室温下使用。
不需要额外的体积计算。

向每个样品中加入500 µl Click- iT TM Plus反应混合物。总体积为600 µl。
在室温下于黑暗中孵育30分钟。
3毫升。一次添加点进智达® 的EdU 透和洗涤试剂和自旋-向下将细胞在4℃300 RCF 7分钟
将细胞用重悬500 Myueru 1 X 点进IT ® 的EdU 透和洗涤试剂和分析使用细胞CytoFlex 流式细胞仪（Beckman Coulter公司）。

数据一Nalysis

细胞掺入的EdU 正在检测用流式细胞仪用指定的荧光基团。门在你的人口的兴趣，并从这个人口上的栅极的EdU Tasu 细胞在直方图或散点图。的EdU Tasu 细胞生发中心往往是一个不同的种群（见下图1b ），但在某些情况下可能会显示为种群的尾巴，具体取决于检测效率。将幼稚的B细胞用作阴性对照，不发生增殖。孵育2.5小时使用EdU ，GC EdU + 细胞群体的正常范围是20％至30％。每个样品共采集了150万个事件。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902740--1370 Adi Biram 784221 \无花果jpg \ Fig1.jpg

图1. 原始，GC和SED PP B细胞中的EdU 分布

注意事项

协议提供详情该对的EdU 检测使用商业试剂盒由Invitrogen，赛默飞世科学的网络℃，并因此改编自套件手册和调整，以我们的实验设置请注意，两个流式细胞仪套件可:.卡嗒IT TM 的EdU 流流式细胞术检测试剂盒和Click- iT TM Plus EdU 流式细胞术检测试剂盒。由于与本协议相关的研究中使用的荧光团具有兼容性，因此该协议只能用Click- iT TM Plus试剂盒重现。

菜谱

1％BSA PBS
1 g BSA，馏分V

100毫升PBS

溶解在摇床上，请勿涡旋

准备新鲜并放在冰上

EdU 溶液（10毫克/毫升）
在Eppendorf管中称量10 mg EdU
溶于1 ml PBS中，并在37°C的干浴中孵育，直到EdU 大部分溶解。
注意：EdU 溶液通常是新鲜制备的，但可以在-20 °C 下保存以备再用。溶解的EdU 溶液的再使用可能需要在37 °C下重新加热以提高其溶解度。

致谢

支持通过ZS欧洲研究委员会（批准号：677713），人类前沿科学计划（批准号CDA-00023/2016），以色列科学基金会（批准号：一零九零年至1018年），阿兹列里基金会，涨潮和基金会莫里斯·卡恩人体免疫研究所（ZS）是欧洲分子生物学组织年轻研究人员计划的成员，并得到了Benoziyo 科学促进基金会，查尔斯· 克洛爵士爵士研究奖，科米萨罗夫家庭信托基金，艾尔玛（Irma）和Jacques Ber-Lehmsdorf 基金会，Gerald O. Mann慈善基金会和David M. Polen 慈善基金会。

该协议提供了有关EdU 体内增殖测定的详细信息，如先前所述（Biram 等，2019）。

竞争利益

作者宣称没有利益冲突。

道德规范

所有实验程序均已由魏兹曼研究所动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循所有相关的道德法规，IACUC编号00960118-4。

参考文献

Biram ，A.，斯特龙伯格，A.，冬季，E.，Stoler -Barak，L.，所罗门，R.，Addadi ，Y.，大寒，R.，Yaari ，G.，Bemark ，M。和舒尔曼，Z （2019）.BCR亲和力差异性调节上皮下圆顶的定植和渗透到Peyer斑内的生发中心。自然免疫学20（4）：482-492。
莫利纳-博洛尼亚，R.，Mosqueda -Taylor，A.，莫利纳- Frechero ，N.，森埃斯特韦斯，A. D。和Sanchez- 阿库尼亚。，G。（2013）比较的值PCNA和Ki-67作为标记物的细胞增殖的成釉细胞瘤医学ö Ral的P 蒂ö 拉尔ç 的Ir 18（2）：E174-E179。
Carreón-Burciaga ，RG，González-González，R.，Molina- Frechero ，N。和Bologna-Molina，R。（2015年）。Ki-67，MCM2和MCM3在成釉细胞瘤和非成膜细胞癌中的免疫表达及其与临床的相关性。和组织病理学模式派息中号Arkers 2015年：683087-683087。
Gitlin，AD，Shulman，Z.和Nussenzweig ，MC（2014）。通过调节的增殖和超突变在生发中心进行克隆选择。Nature 509（7502）：637-640。
Huang，KT，Chen，YH和Walker，AM（2004）。MTS分析的不准确性：培养基，血清白蛋白和脂肪酸的主要扭曲作用。生物技术37（3）：406，408，410-402。
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Ouadah ，Y.，哈斯，ER，Riordan的，DP，Capostagno ，S.，郭，Cs和KRASNOW ，MA（2019）。稀有肺神经内分泌细胞是干监管被R b，P53，和Notch细胞。细胞179（2）：403-416 e423。
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