材料和试剂

12孔细胞培养板（Fisher Scientific，目录号：12556005）
猎鹰5毫升圆底试管，带35 MYU中号过滤器盖子（康宁公司，目录号：352235）
293FT电池（Thermo Fisher，货号：R70007）
EMC4-KO 293FT电池（如PMID：31516121中所述生成）
Stbl3感受态大肠杆菌（MacroLab ，目录号：Stbl3）
从pX458扩增的eGFP 编码序列（来自张锋的礼物; Addgene 质粒，目录号：48138）
从pCAGGS-mCherry 扩增的mCherry 编码序列（Phil Sharp的礼物；Addgene 质粒，目录号：41583）
从pcDNA3 Flag beta-1-肾上腺素能受体扩增的ADRB1 编码序列（来自Robert Lefkowitz的礼物；Addgene 质粒，目录号：14698）
从感染性克隆中扩增出的登革热病毒血清型2 16681株NS4A-NS4B编码序列（来自Karla Kirkegaard的礼物，NCBI参考序列：NC_001474）
Kapa HiFi HotStart ReadyMix （Kapa Biosystems，目录号：KK2602）
DNA寡核苷酸（集成DNA技术，序列见表1）

表1. DNA寡核苷酸序列

引物名称

DNA序列

慢病毒-CMV-EGFP-F

TGTGGTGGAATTCTGCAGATGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG

EGFP-T2A_GIBSON-R

CCTCGACGTCACCGCATGTTAGCAGACTTCCTCTGCCCTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC

T2A-MCHERRY-F

TCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA GTGAGCAAGGGCGAGGAGGA

MCHERRY-PLENTI-R

CGGCCGCCACTGTGCTGGATTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC

慢病毒-CMV-ADRB1-F

TGTGGTGGAATTCTGCAGATGCCACCATGGGCGCGGGGGTGTGCTCG

ADRB1（NOSTOP）_GFP-R

ACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCACCTTGGATTCCGAGGCGA

荧光蛋白

GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT

PLENTI-CMV-DENV_NS4A-F

TGTGGTGGAATTCTGCAGATGCCACCATGTCTCTGACCCTGAACCTAATCAC

DENV_NS4B_GFP-R

TGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCCTTCTTGTGTTGGTTGTGTTC

QIAquick 凝胶提取试剂盒（Qiage n，目录号：28706）
分子生物学琼脂糖（Bio-Rad，目录号：1613102）
NEBuilder ® 高保真DNA大会预混（新英格兰生物实验室，目录号：E2621L）
pLenti CMV Puro DEST（w118-1）（来自Eric Campeau和Paul Kaufman的礼物；Addgene 质粒，目录号：17452）
EcoRV -HF（新英格兰生物实验室，目录号：R3195S）
快速CIP（新英格兰生物实验室，目录号：M0525S）
小号。Ó 。Ç 。培养基（Teknova ，目录号：S1657）
具有羧苄青霉素的LB琼脂平板（Teknova ，目录号：L1010）
LB Broth（Teknova ，目录号：L8050）
羧苄青霉素100 mg / ml（Teknova ，目录号：C2135）
QIAfilter Plasmid Midi Kit（Qiagen，目录号：12243）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：11965118）
胎牛血清（FBS）（欧米茄（Omega）科学，目录号：FB- 11）
Opti-MEM还原血清培养基（Life Technologies，目录号：3198506 2）
青霉素链霉素100x（Life Technologies，目录号：15140122）
L-谷氨酰胺100x（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190-250）
胰蛋白酶-EDTA 0.05％（Life Technologies，目录号：25300120）
的TransIT ® -LT1转染试剂（Mirus公司简介，目录号：MIR2300）
Lipofectamine 3000转染试剂（Fisher Scientific，目录号：L3000008）
293FT的培养基（请参阅食谱）

配套设备

Nanodrop One微体积紫外可见分光光度计（Thermo Fisher，目录号：ND-ONE-W）
具有488和561nm激光器的CytoFLEX S V4-B2-Y4-R3流式细胞仪（Beckman Coulter，目录号：B96621）
摇床
水浴

软体类

CytExpert 版本2.3（Beckman Coulter Inc.，https: //www.beckmancoulter.com/ ）
FlowJo v10.6.1（FlowJo ，LL C，https: //www.flowjo.com/ ）
Microsoft Excel（Microsoft Corp.，https：//www.microsoft.com/zh-cn/）。
Prism 8（GraphPad Software，LLC，https://www.graphpad.com/）

程序

双荧光报告基因构建体的克隆
设计用于扩增目的基因（此处为ADRB1或登革热NS4A-4B），eGFP 和mCherry 的引物，在相邻片段之间添加20-30 bp 重叠以组装多个DNA片段。包含权益重叠左臂的EcoRV -Linearized PLenti CMV普罗DEST（W118-1），Kozak序列和一个ATG起始密码子。ŧ 他反向引物重叠小号与5 '末端的中EGFP 编码序列。反向底漆EGFP 具有无终止密码子，包含悬垂编码第一〜40个碱基对T2A因此造成的重叠与T2A-mCherry的片段。mCherry的被放大的正向引物含有部分的T2A序列和反向引物与终止密码子的并与EcoRV 线性化的pLenti CMV Puro DEST（w118-1）的右臂重叠。可以生成仅编码eGFP-T2A-mCherry的对照构建体，其中eGFP的正向引物与EGFP 的左臂重叠。EcoRV 线性化pLe NTI CMV普罗DEST（W118-1），Kozak序列和一个ATG起始密码子。
使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix （或任何其他高保真聚合酶）从质粒模板扩增DNA片段。使用制造商建议的PCR循环条件.PCR之后，在1％琼脂糖凝胶上运行扩增的片段，然后使用凝胶纯化试剂盒。
纯化的PCR片段聚集在一起随着EcoRV位-Linearized和CIP处理Plenti -CMV -普罗质粒使用NEBuilder ® 高保真DNA大会预混根据制造商的说明。请注意，其他哺乳动物表达载体可以被用作收件人质粒但是你需要修改突出端序列的组件的多个DNA片段在小号Tep的阿1因此。
通过在42 ℃加热震荡，用组装的质粒转化Stbl3 大肠杆菌 ℃下水浴45秒。恢复热冲击菌S中。Ö 。Ç 。培养基和30 ℃下摇床1个小时在225 RPM。传播转化的细菌为10毫米的琼脂板，其在含100 微克/毫升羧苄青霉素，并培育在30 ℃ 或37 ℃ 过夜。
第二天，从培养皿中挑选一个菌落，接种50 ml含有100μg / ml羧苄青霉素的LB肉汤。在30 °C 摇动接种的LB肉汤（如果质粒序列易于重组，例如慢病毒质粒）或37 C° 摇床以225rpm过夜。
根据制造商的说明，使用质粒DNA Midiprep 试剂盒从大肠杆菌中提取质粒DNA 。使用Nanodrop确定核酸的浓度和纯度（260/280比率）序列-使用eGFP 上游的正向引物通过Sanger测序验证质粒插入物和mCherry 下游的反向引物。

细胞系转染
在转染前一天，使用293FT培养基将3 x 10 5 293FT细胞（WT和EMC4 KO基因型）接种在12孔板中（见食谱）。铺板后24 h，细胞应融合70％-80％。
第二天，转染荧光双构建体导入293FT细胞利用Mirus公司的TransIT ® -LT1转染试剂或脂质体3000。要做到这一点，淡化所需金额质粒DNA在无血清培养基或OptiMEM中，并添加转染试剂根据制造商的说明然后，添加DNA-脂质复合物聚集到细胞中。

流式细胞仪分析
24-48的后小时，分离CEL LS由加法100 微升0.05％胰蛋白酶-EDTA每孔中，接着温育在37 ℃下3分钟。灭活胰蛋白酶由加法的，等体积的培养基含有FBS。通行证细胞通过35 微米中号细胞过滤器，以获得一个单- 细胞悬液。
在流式细胞仪上分析细胞，首先，使用未转染的细胞绘制阴性门，前向门（FSC）和侧向散射（SSC），然后FSC的高度和面积用于单线门，然后mCherry 荧光（mCherry 阳性细胞是转染的细胞中成功），最后是绿色荧光蛋白。荧光然后运行你的样品（EGFP-2A-mCherry的控制和蛋白质的兴趣构建）记录5 ×10 3 - 5 ×10个4 的mCherry 阳性事件数转染样品。

图1.双荧光细胞计数法的实验设计A. 哺乳动物表达盒的示意图，显示感兴趣的基因，接着是eGFP ，病毒T2A序列和mCherry。产生带有突出端的DNA片段的引物用黑色箭头指示（1F = PLENTI-CMV-ADRB1-F或PLENTI-CMV-DENV_NS4A-F; 1R = ADRB1（NOSTOP）_GFP-R或DENV_NS4B_GFP-R; 2F = EGFP-F; 2R = EGFP-T2A_GIBSON-R; 3F = T2A的F - mCherry的; 3R = 的mCherry-PLENTI-R）转录。mRNA分子同时编码荧光蛋白，然后将其译成两种蛋白产品通过肽键跳跃在T2A网站这将导致生产GFP融合蛋白。mCherry的在最初1：1化学计量因此，该EGFP：mCherry的比例允许测量è .. Ffects蛋白质水平合成后B.实验工作流程EGFP-T2A-mCherry的报道构建体转染到细胞不同的实验条件中（例如，野生型vs山雀（t基因型，药物治疗，细胞应激等）。然后使用流式细胞仪分析细胞的GFP和mCherry 荧光水平。最后，在不同的实验条件下计算目标蛋白的eGFP：mCherry 比值并绘制为频率分布图。

资料分析

FCS文件从CytExpert细胞计数仪软件中导出并导入FlowJo 10中以进行FACS分析。门控顺序如下：FSC-H / SSC-H（细胞与碎片），FSC-H / FSC-A（细胞），ECD -H（mCherry 通道）/ FSC-H和FITC-H（eGFP 通道）/ FSC-H。首先，使用未转染的细胞设置mCherry 和eGFP 荧光的阴性门，然后将所有门应用于其余样品。mCherry 阳性细胞代表成功转染的细胞。由于GFP和mCherry 在相同的构建体/启动子中表达，因此所有mCherry 阳性细胞也都具有GFP荧光。将mCherry 阳性门控群体的相对强度值以逗号分隔值（CSV）导出。），然后在“ mCherry 阳性”组上单击鼠标右键，然后在“导出/并置组” 上单击鼠标右键。
该计算EGFP -TO- mCherry的比率各行中的所有数据表（每一行代表一个单独的记录单元）U 星Microsoft Excel中。作为EGFP 和mCherry的具有较高的结构相似，并表示在相同启动子，它可以假定他们水平是相同的蛋白质。因此，使用将样品与EGFP-2A-mCherry的只有构建并计算平均值所有EGFP -TO- mCherry的比率，平均比例将被应用作为换算系数应用至EGFP -TO- 的mCherry 将所有其他样品的比率进行归一化，以标准化eGFP 和mCherry 通道之间的激光强度和检测器设置的差异。
标准化的导入EGFP -TO- mCherry的价值观对每个样品到列表在棱镜8.选择“分析”和“频率分布”，以便生成柱状图所有算出的荧光比例。选择“频率分布”未明镜创建和选择“ XY图”作为输出，也可以使用其他软件包（如R或Python）生成直方图。

图2.双荧光细胞计数法的示例数据A. FlowJo 中转染细胞的门控策略：前向和侧向散射，单峰，mCherry 荧光和eGFP 荧光。单个mCherry 阳性细胞的荧光强度值输出用于下游分析。B.CSV 表的示例，该表包含转染到野生型293FT 细胞中的ADRB1-eGFP-T2A-mCherry构建体的单个荧光强度值.eGFP：mCherry 比从强度值计算并通过eGFP：mCherry 比的平均值进行归一化。。只有在EGFP-T2A-mCherry的构造类似的表生成用于其他样品EGFP：mCherry的。比例对所有样品进行归一平均值的比率在EGFP-T2A-mCherry的样品终于，归一化比率导入到棱镜8尽管仅eGFP的水平不受EMC4敲除的影响，但ADRB1和登革热NS4A-4B在缺乏EMC4的细胞中显示出降低的表达。

菜谱

293FT培养基
500毫升Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）

米50 大号热灭活的FBS

米5 升100X青霉素和链霉素（最终浓度100U / ml）的

米5 升100X L-谷氨酰胺（终浓度2mM）的

致谢

该协议基于eLife （Ngo 等人，2019）中发布的先前工作和示例数据。

竞争利益

作者没有任何竞争利益。

参考文献

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Itakura ，E.，Zavodszky ，E.，Shao，S.，Wohlever ，ML，Keenan，RJ和Hegde，RS（2016）。Ubiquilins分子伴侣和线粒体膜蛋白的降解。Mol Cell 63（1）：21-33 。
非政府组织，AM，舒特尔夫，MJ，波波娃，KD，Kulsuptrakul ，J.，韦斯曼，JS和Puschnik，AS（2019）的ER膜蛋白复合物是必需的，以确保正确的拓扑结构和稳定表达黄病毒多蛋白的。网上生活8 ：E48469 。
Vogel，C.和Marcotte，EM（2012）。蛋白质组学和转录组学分析对蛋白质丰度调控的见解。Nat Rev Genet 13（4）：227-232。