材料和试剂

2 ml微量离心管（Tarson ，目录号：500020）
培养管（55 ml，乙腈，目录号：9820U08）
GC样品瓶（安捷伦，目录号：5190-2280）
封口膜（西格玛（Sigma），目录号：P7793）
0.2 MYU 中号过滤器（MDI 膜技术，目录号：SYNN0301MNXX104 ）
在pQE30载体中克隆了过量表达ADO酶的大肠杆菌DH5α菌株（菌株来源：Invitrogen，载体来源：Qiagen）
十六烷（TCI America，货号：H1296）
十八碳烯（TCI美国，目录号：S0348）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Merck，目录号：255793）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma，目录号：P5655）
氯化钠（NaCl）（西格玛（Sigma），目录号：S9888）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma，目录号：213330）
七水硫酸镁（MgSO 4· 7H 2 O）（西格玛，目录号：230391）
氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma，目录号：C4901）
六水合氯化铁（FeCl 3 · 6H 2 O）（Sigma，目录号：236489）
氯化锌（ZnCl 2 ）（Sigma，目录号：746355）
二水合钼酸钠（Na 2 MoO 4 · 2H 2 O）（Sigma，目录号：331058）
硫酸铜（CuSO 4 ）（Sigma，目录号：C1297）
硼酸（H 3 BO 3 ）（Sigma，目录号：B7901）
盐酸硫胺素（Sigma，目录号：T4625）
葡萄糖（西格玛（Sigma），目录号：G8270）
Bis Tris （Amresco ，目录号：0715-250G）
海卫一X-100（Amresco ，货号：M143-1L）
乙酸乙酯（默克（Merck），目录号：1096232500）
IPTG（Sigma，目录号：I6758 ）
LB肉汤（HiMedia ，目录号：M1245）
氨苄西林（Sigma，目录号：A9393）
M9盐（请参阅食谱）
M9改良培养基（请参阅食谱）

配套设备

离心机表仪（Eppendorf，型号小号：5418R和5810R）
孵化器摇床（Kuhner ，型号：ISF-1）
FID GC（安捷伦，中号奥德尔：7 890 系统，配有HP-5柱，目录号19091J-413）
分光光度计（GE医疗集团，中号Odel等：Ultrospec TM 2100）
涡流（Sigma，目录号：Z258423-1EA）
高压釜（大众钢铁，中号奥德尔：24 SR）

程序

体内培养
接种大肠杆菌菌株窝藏质粒携带ADO基因（图茜2）从平皿上划线，并保温过夜。在37℃（板本来挑染从甘油原种）在5 毫升的LB肉汤培养基中5 MYU 大号APPR中Opriate抗生素（氨苄西林– 100 MYU ģ / ml的用于氏书房）在55个毫升培养试管（1毫升氨苄青霉素股票100mg / ml的制备通过添加氨苄西林粉末在1毫升水，接着过滤除菌）100mg的。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902816--1339 Syed Yazdani 636936 \无花果jpg \图2.jpg

图茜2.示意图中涉及的烷烃通路建设。质粒质粒矢量地图PQE_ADO ，携带阿土基因PQE30质粒在酶切位点的Bam HI / 萨克我。

将样品在设置为180 rpm的恒温振荡器中于37°C孵育过夜。
50使用MYU 大号（OD 600 范围从3-4）主接种物生长过夜接种3毫升的二级培养哈咏M9修饰的M Edium（配方1 用补充有2 Pasento葡萄糖，）为1mg / 大号硫胺素和100 MYU ģ /毫升氨苄青霉素。
所述培养物与诱导0.01 MM IPTG（3 MYU 大号10 MM IPTG至3ml培养）在当时二次接种在M9培养基中，因为质粒PQE30实施ADO基因是可诱导通过IPTG 。
添加为100mg / 大号十六烷（溶解于无水乙醇）外源性到培养基中，在当时二级培接种和密封培养管用封口膜，以防止任何损失衬底或产品中由于蒸发（15 MYU 大号为20毫克/毫升储备液加入3毫升培养液中）。
在设置为120 rpm 的n培养箱中，将培养管在30°C（或更高温度下测试热稳定酶）中培养48 小时。

碳氢化合物提取
在进行烷烃萃取之前，先测量样品在600 nm处的光密度，以估算生长量。
等体积取样品和乙酸乙酯（0.75毫升）（含有10毫克/ 大号十八碳烯的加入作为内标- 从100毫升的股票乙酸乙酯的含有1.265 微升的99％的1-十八碳烯）在2ml微量离心管。
将样品涡旋20分钟，然后在室温下以15,700 xg离心3分钟。
收集上层馏分，将其等分到新鲜的GC（气相色谱）小瓶中。
使用气相色谱仪（GC）分析样品。

碳氢化合物分析
在配备30 m长，0.32 mm内径和0.25 mm膜厚的HP-5色谱柱的气相色谱（GC）系统上设置碳氢化合物分析方法，使用FID检测器进行分析。烤箱温度程序设置为：初始100°C保持3分钟，以10°C min -1 的速率将温度升至250°C，再在250°C保持10 分钟。程序的时间为28 分钟。入口温度和检测器温度分别保持在150°C和280°C。
运行十五烷，十六烷，1-十八和十六醇标准已知量（图茜3）之前，样品分析曲线下和使用面积，计算代谢物在测试样品的浓度。
运行测试样品在GC机（图茜4）和量化十五烷含量相对于它的标准。

资料分析

代表数据

有关详细的数据分析，请参阅Shakeel 等人的文章（2018年）。图3 显示了所有标准品的代表性GC色谱图。这些标准品的已知量曲线下面积用于量化代谢产物中的代谢物。试验样品的。代表GC色谱为典型的体内样本含烷烃见图茜在曲线中的每个代谢物4.面积来计算其浓度通过它比较曲线下面积相应标准已知量的。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902816--1339 Syed Yazdani 636936 \图jpg \图3-ms.jpg

图茜3. GC色谱图的标准代谢产物。甲。Ç Hromatogram中十六醇和1-十八碳烯。乙。Ç Hromatogram中十六烷和1-十八烯。Ç 。Ç Hromatogram中十五烷和1-十八碳烯。该1-十八碳烯，使用作为检查萃取效率的内在标准，而其他代谢物则是烃萃取后观察到的底物（十六烷醛）或产物（十六烷醇和十五烷）。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902816--1339 Syed Yazdani 636936 \图jpg \图4-ms.jpg

图茜4.功能ADO蛋白在重组大肠杆菌中的加成外源前体之后即十六烷。阿。GC色谱对照样品含有十六烷和内部标准。乙。GC色谱图大肠杆菌表达空PQE30质粒，显示峰值ö ˚F 十六烷和十六醇。ç 。GC色谱的大肠杆菌表达PQE_ADO ，显示形成最终代谢产物即，十五烷和十六醇。

菜谱

M9 改良培养基
M9修饰培养基的成分制备如下：

M9盐
对于100毫升M9盐（10倍）

11.32克Na 2 HPO 4

3克KH 2 PO 4

1克氯化钠

2克NH 4 Cl

补足体积100毫升加MQ水并过滤除菌使用0.2 MYU 中号过滤器

微量元素配方
1x 微量元素组成：

ģ0.25 / 大号硫酸镁4 · 7H 2 ö

11 mg / L 氯化钙2

18.71 mg / L FeCl 3 · 6H 2 O

1.311 mg / L ZnCl 2 · 4H 2 O

2 mg / L Na 2 MoO 4 · 2H 2 O

1.9毫克/ 升CuSO 4

0.5 mg / L H 3 BO 3 （硼酸）

1毫克/ 升硫胺素

上述组分都是单独准备作为100X股票在MQ水中并过滤除菌使用0.2 MYU 中号过滤器

1x 添加剂成分
200 mM Bis Tris （准备了5份库存）

0.1％Triton X -100（准备了10倍库存）

2％葡萄糖（准备了10倍储备液）

上述组分都是单独制备为MQ水并过滤除菌使用0.2 MYU 中号过滤器

依次混合（a），（b）和（c）的1x成分，并用121℃的MQ水高压灭菌至100 ml ℃ 20分钟。

致谢

这项研究由印度政府生物技术部授予SSY的资助，资助号为BT / PB / Center / 03/2011 和BT / IN / INDO-UK / SuBB / 21 / SSY / 2013 。改编自当时法特玛等人。年，2016年，其中方法用于筛选的大肠杆菌内源性醛还原酶负责的转换长链醛醇，并从沙基尔等人，2018所述方法被用来筛选热稳定的ADO。

竞争利益

作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。

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