材料和试剂

-Well细胞培养12板（ģ 莱纳乙IO ø NE，蜂星® ，目录号的：665180）
不含吸头的血清移液管10 ml（SARSTEDT，目录号：86.1688.010）
P200移液器吸头
M 20 大号注射器（VWR，目录号：613-2046）
0.22 µm针头过滤器（GE Healthcare，Whatman TM Uniflo ，目录号：9915-2502）
六-N- 乙酰基乙酰己糖（推荐两家制造商：圣克鲁斯生物技术，目录号：sc-222018; 伊索塞普（Isosep），目录号：56 / 11-0010）。存储在-20 °C
注意：可以使用壳庚糖（NAG7）和壳八糖（NAG8）甚至几丁质（Sigma ，目录号：C7170）代替壳六糖。

鞭毛蛋白22肽（flg22：QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA）（Genscript，目录号：RP19986）。在-20°C下保存
作者：的Gamborg 维生素溶液1 ，000X（无菌）（Sigma-Aldrich公司，目录号：G1019-50 ML 。）储存在4 ℃下
注意：在使用前，请检查是否有沉淀物存在（如果存在），将溶液加热至42°C并涡旋直至所有沉淀物溶解。

Murashige 和Skoog基础盐混合物（PhytoTechnology 实验室，目录号：M524）。储存在4 °C
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S5391）
肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I7508）
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：T1270）。储存在4 °C
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
胰蛋白（（Oxoid ，目录号：LP0042 ）。
2,4-二氯苯氧基乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：D7299）
2-（N- 吗啉代）乙磺酸（MES）水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
Kinetin（Sigma-Aldrich，目录号：K0753）
六聚体（NAG6）解决方案（请参阅食谱）
Flg22解决方案（请参阅食谱）
Kinetin储备溶液（1,000x）（请参阅食谱）
2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）储备溶液（1,000x）（请参阅配方）
KH 2 PO 4 储备溶液（请参阅配方）
硫胺素/肌醇原液（参见食谱）
胰蛋白stock储备溶液（10％）（请参阅食谱）
MES /磷酸盐缓冲培养基（请参阅食谱）
传代培养基（请参见食谱）

配套设备

125 ml锥形瓶（Pyrex TM ，目录号：15685767）
250 ml锥形瓶（Pyrex TM ，目录号：11902619）
P200可调移液器
通风橱（Thermo Scientific，型号：1300系列II类，目录号：1323TS）
高压灭菌器（VWR，目录号：481-0666）
pH计（Mettler Toledo，Seven Compact S220 Basic ，目录号：30019028）。可以使用其他型号，只要pH分辨率至少为0.001
小体积pH传感器InLab Micro （Mettler Toledo，目录号：51343160）
轨道振动筛（LaboTech ，型号：RS150）

软体类

微软Excel
EasyDirect TM pH软件（Mettler Toledo，30323214）

程序

细胞悬液的制备和维护
这里描述的协议使用的是烟草（Nicot iana tabacum）品种亮黄色2（BY-2）细胞悬液，该细胞悬液是由体外诱导的愈伤组织建立的（图1A）.BY-2细胞系由Kato 等人从烟草幼苗中产生。1972年（加藤等人，1972年）一钕，此后一直传播并共享其中植物科学家（永田等，1992）。BY-2 细胞是否目前作为模型在一些实验系统，并且可从不同研究小组。

以生成悬浮植物细胞的，输送约1 毫升的愈伤组织到无菌的125毫升锥形瓶中含有20ml的MES /磷酸盐缓冲培养基（配方8 ）使用无菌稚贝ù Ia或INOC ù 特征研环路（在..流罩）温和地避免不必要的机械应力愈伤组织，以防止污染，工作Caref ü LLY 有序的流罩孵育27 ℃，在黑暗中缓慢的搅拌下（100 - 120转）甲在ñ 轨道振荡器。愈伤组织将释放小细胞聚集体，将最终的RE 的UI T IN的细胞悬浮液。
10-14天之后，将5 毫升的RES 的UI 汀细胞悬浮，用10个毫升无针尖血清移液管至无菌250 毫升Erlenmeyer烧瓶中含有45 毫升中传代培养培养基（配方9 ）。孵育于27℃在黑暗中温和搅拌下（100 - 120转）在甲ñ 轨道摇床。
7天之后，重复SUBC 的UI 图灵如上所述在步骤阿2。此时，新建立的细胞悬浮昭的UI d类似于示出一个在图小号1B- 1 C.检查等分试样悬浮液下有关的显微镜确保没有污染物。
登记费的UI 氩维护BY-2细胞悬液，SUBC 的UI 真实姿态细胞周刊所描述的步骤一2.最好是按惯例保留两个或三个独立瓶悬浮细胞，防止的C 的UI 真实姿态造成的损失污染。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902926--1315 Paulo Teixeira 696431 \ Figs jpg \ Figure1.jpg

图1 。烟草栽培种生长为愈伤组织和细胞悬浮液嫩黄2（BY-2）细胞。阿。愈伤组织在固体MES生长/磷酸盐缓冲Ç UL TURE平台。乙。刚过细胞悬液SUBC UL 图灵。Ç 。A 7日龄细胞悬液。注意：浅黄色颜色指示饱和度。

MAMP处理和中等碱度的测量
一旦建立了可用的细胞悬浮液（如上一节所述），就可以使用MAMP触发的培养基碱化，将等分试样的细胞悬浮液分别用MAMPs处理并探查是否有应答（图2）。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902926--1315 Paulo Teixeira 696431 \ Figs jpg \ Figure2.jpg

图2 。实验设置对于中等碱化测量。12孔微孔板含2.5 毫升细胞悬液每孔保持缓慢的搅拌下在轨道振荡器上。pH传感器插入使探头完全被浸没，而不接触墙壁。

用10毫升无针血清移液器小心地将3至5天大的细胞悬液转移至12孔板（每孔2.5毫升）中。所用的细胞培养物应与图1C所示的相似，浅黄色或棕褐色的悬浮液通常会受到压力，因此不应使用。
注意：影响培养基碱化分析的一个关键因素是细胞悬浮液的年龄。在我们的BY-2细胞实验中，我们使用了3至5天的悬浮液，但是最佳年龄可能因实验室而异实验室，因此需要通过实验确定。

将培养板至少2 ħ 和最多4 ħ 在室温和在温和搅拌下在轨道摇床（通常为100 - 200转;速度昭的UI 。d恰好足以使细胞保持悬浮）该步骤允许细胞可以从转移到板引起的应力中恢复。
开始测量之前，请适当调整pH计设置：0.001的测量分辨率，终点格式设置为3 s的手动和定时间隔读数。根据制造商的建议，使用校准标准溶液校准传感器。
在连接到pH 计的计算机上打开EasyDirect TM pH软件，并将导出选项设置为Excel 。将自动打开Excel工作表。
维持板块在搅拌下对轨道摇床（100 - 200转），插入传感器于一体的，Caref 的UI Ly的调整位置，以确保传感器完全插入（吸头浸入式），而不是触摸墙壁或井底。
按下pH计上的开始按钮。仪器将开始在Excel表中记录pH值。
一旦测量变得稳定（相同的值的至少12 S），添加25 Myueru 1 MyuM NAG6（配方1）（终浓度：10 NM ）或25 Myueru 中10 MYU 中号Flg22（拍摄蚁2 ）（最终浓度：100 NM ）到井，为了避免人工的变化在PH值，下平衡的诱抗剂至室温10 敏之前添加到细胞悬浮液。确保每个板包括至少一个处理好的随着诱发剂解决Nt个（H 2 O）作为未引起的控制。
记录NAG6 10分钟和flg22 60分钟的pH值。
测量完成后，从孔中取出传感器，用超纯水彻底清洗并用薄纸擦干。
重复步骤B5-B9，直到测试了实验中包括的所有样品。

资料分析

该EasyDirect TM PH软件功能导出工具，用于记录测量pH值直接插入Excel工作表。因此，一旦所有原始数据从实验中被收集，则变化在PH（DerutapH ）一段时间内各个测试条件，可以计算为S Ubtracting测量的时间0（PH值即，为媒介的PH MAMP处理前）从pH在每个随后的时间点（即，为媒介的PH甲基苯丙胺治疗后）。线图描绘了变化pH值随时间（图3a）或酒吧图，显示的最大DerutapH 值（图3B），每次治疗可绘制可视化水库的UI TS，标准偏差翔的UI d提交指明变化在重复测试，最好是至少有3个生物针对每个测试条件进行复制。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902926--1315 Paulo Teixeira 696431 \ Figs jpg \ Figure3.jpg

图3 。NAG6诱导培养基碱化烟草BY-2细胞悬液。治疗用10细胞悬浮液的PH NM NAG6或者的UI Trapure水（模拟）被记录为10 闵后的治疗。甲。变化在PH（DerutapH ）时间过（在秒所示）线图; B 。中号Aximum变化在PH绘制成的柱状图。灯罩在线路图和误差条柱状图表示标准偏差的3个生物重复中。

注意事项

替代为无针尖血清移液管，它可以切割终结的注册ü 大号氩血清移液管，甚至从P5000提示，并用它来处理的细胞悬液。

菜谱

六聚体（NAG6）解决方案
溶于无菌超纯水中至1 µM（1.24 µg / ml ）。

储存在-20°C

Flg22 解决方案
溶于无菌超纯水中至10 µM（22.7 µg / ml ）。

储存在-20°C

Kinetin储备溶液（1,000x）
将0.1 mg / ml激动素溶解在1/10体积（每毫升100 µl）的1 M NaOH水溶液中
粉末溶解后，用超纯水补足最终体积
过滤除菌并储存在-20°C
2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）储备溶液（1,000x）
将1 mg / ml 2,4-D溶于无水乙醇

储存在-20°C

KH 2 PO 4 储备溶液
将60 mg / ml KH 2 PO 4 溶解在去离子水中
准备10毫升等分试样并储存在-20°C
硫胺素/肌醇原液
将0.1 mg / ml盐酸硫胺素和10 mg / ml肌醇溶于去离子水中
准备3毫升等分试样并储存在-20°C
胰蛋白stock原液（10％）
在去离子水中溶解10 g / L胰蛋白water
通过高压灭菌或通过0.22 µm注射器式过滤器进行灭菌
室温保存
MES /磷酸盐缓冲培养基
组成：

0.5 g / L 2-（N- 吗啉代）乙磺酸（MES）水合物

30克/ 升蔗糖

1 x Murashige 和Skoog基础盐

100 mg / L 肌醇

1毫克/ 升盐酸硫胺素（维生素B1）

0.18 g / L KH 2 PO 4

0.22 mg / L （0.1 µM）2,4-二氯苯氧基乙酸

1％胰蛋白p

pH值5.7

准备（1 升）：

将4.3克Murashige 和Skoog基础盐混合物，30克蔗糖和0.5克MES 水合物溶解在900毫升去离子水中
使用1 M KOH水溶液将pH调节至5.7
加入3 ml KH 2 PO 4 储备溶液，10 ml硫胺/肌醇储备溶液和220 µl 2,4-D储备溶液
用去离子水将最终体积完成至1 L
18毫升分装转移至125ml Ë Rlenmeyer瓶
在121°C和15 psi下高压灭菌20分钟
平衡在室温后，加入2毫升蛋白胨储备液。介质是随时可以使用
传代培养基
组成：

1x Murashige 和Skoog基础盐

30克/ 升蔗糖

1x Gamborg的维生素

1 mg / L （4.5 µM）2,4-二氯苯氧基乙酸

0.1毫克/ 升（0.46 µM）激动素

pH值5.7

准备（1升）：

将4.3克Murashige 和Skoog基础盐混合物和30克蔗糖溶解在900毫升去离子水中
使用1 M KOH水溶液将pH调节至5.7
用去离子水完成最终体积
将45毫升等分试样转移到25 0毫升锥形瓶中
在121°C和15 psi下高压灭菌20分钟
平衡在室温后，转移蒸压瓶给一个流罩添加45 Myueru 1 ，000X 的Gamborg 维生素溶液（无菌），45 Myueru中2,4-二氯苯氧乙酸原液和45 Myueru中激动素原液。中型企业准备使用

致谢

该协议详细描述了Fiorin 等人（2018）的研究报告中使用的MAMP触发的细胞悬浮液培养基碱化的程序。这项研究由圣保罗研究基金会（FAPESP）通过研究金09 / 51018- 1、09 / 50119-9、11 / 23315-1、13 / 09878-9和14 / 06181-0。

竞争利益

作者声明没有利益冲突。

参考文献

Bigeard ，J.，Colcombet ，J. and Hirt，H.（2015）。模式触发免疫（PTI）的信号传导机制。分子植物8（4）：521-539。
Bisceglia ，NG，Gravino ，M。和Savatin ，DV（2015）。鲁米诺基于检测方法的免疫激发子诱导的过氧化氢生产中拟南芥叶片。生物协议5（24）：E1685。
波姆，H.，阿尔伯特，I.，电风扇，L.，莱因哈德，A. 和纽伦堡，T。（2014）。免疫受体复合在植物细胞表面。 CURR OPIN 植物生物学20：47 - 54。
Boutrot ，F. 和Zipfel，C。（2017）。功能，发现和开发植物的模式识别受体为广谱抗病性。 Annu 启Phytopathol 55（1）：257-286。
库克，DE，Mesarich ，CH 和托马，BPHJ（2015年）理解植物免疫作为监视系统来检测入侵。 Annu 版本Phytopathol 53（1）：541-563。
Fiorin，GL，Sanchéz-Vallet，A.，Thomazella，DP de T.，do Prado，PFV，do Nascimento，LC，Figueira，AV and de O.Teixeira，PJPL（2018）。真菌几丁质酶抑制植物免疫力。效应一样。当代生物学28（18）：302 3 - 3030 。
Flury ，P.，Klauser ，D.，Boller ，T. 和Bartels，S.（2013）。拟南芥叶盘的 MAPK 磷酸化测定。生物协议3（19）：e929。
加藤，K.，松本，T.，小岩井，A.，水崎。，S.，西田，K.，野口，M。和玉置，E。（1972）液体悬浮Ç ù Lture烟草细胞。我Ñ ：。发酵技术今日特锐，G ^ 。（编。）发酵技术，大阪，第689学会- 695。
Liu，F.，Xu，Y.，Wang，Y. and Wang，Y.（2018）。PAMP 诱导的本氏烟草标记基因表达的实时PCR分析。生物协议8（19）：e3031。
Moroz ，N.，Fritch，KR，Marcec ，MJ，Tripathi，D.，Smertenko ，A. 和Tanaka，K.（2017）。细胞外碱化作为马铃薯细胞的防御反应。植物科学8:32。
Nagata，T.，Nemoto，Y.和Hasezawa，S.（1992）。烟草BY-2细胞系作为高等植物细胞生物学中的“ HeLa”细胞， Int Rev Cytol 132：1-30。
Nühse ，TS，Peck，SC，Hirt，H。和Boller ，T。（2000）。微生物引发剂诱导拟南芥MAPK 6的活化和双重磷酸化。JBiol Chem 275（11）：7521-7526。
Ranf ，S.，Eschen-Lippold ，L.，Pecher ，P.，Lee，J. and Scheel，D.（2011）。在对微生物或与损伤相关的分子模式的防御反应中，钙信号与早期信号元素之间的相互作用。。植物杂志68（1）：100-113。