材料和试剂

1. P IP Ë TTE提示

2. Sarstedt 96孔板（Sarstedt ，目录号：83.3924）（或类似产品）

3. 1.5毫升管

4. 纯化的病毒库存（1 μ克病毒的每个测量井; 储存在-80 °C）

肠病毒的纯化可以使用5-20％或10-40％的蔗糖梯度进行，并在原始出版物中有详细描述（Ruokolainen 等，2019）。同样，可以使用CsCl 纯化，但是我们观察到批次之间的差异比蔗糖纯化的病毒更大。已对该协议进行了测试，并观察到它可与回声病毒1以及柯萨奇病毒A9和B3一起使用，这表明该协议广泛适用于肠病毒，也可能适用于微小RNA病毒。

5. 您感兴趣的缓冲/解决方案

在我们的论文中，我们使用了各种浓度的不同离子和白蛋白来研究病毒的启动和开启。例如，补充有0的DPBS溶液。01％BSA导致大量的中间病毒颗粒。

6. SYBR Green II RNA凝胶染料（Invitrogen；ThermoFisher Scientific，目录号S7564；存储在-20°C）

7. RNase A，10 mg / ml（ThermoFisher Scientific目录号EN0531；在-20 °C 储存）

8. 150 mM NaCl溶液

9. 冰

设备

移液器的体积范围包括100 µl
8通道多管移液器，体积范围包括50 µl或类似体积（可选）
Perkin Elmer 2030多标签读取器Victor X4（或类似的荧光板读取器，带有合适的过滤器选项）

软件

Perkin Elmer 2030经理
微软Excel

程序

样品制备
放置96 - 冰孔板降温。
注：哟u可以使用的金属板冰的顶部，让即使是表面与板容易处理。

在冰上冷却感兴趣的溶液。
用10,000x SYBR Green II储备溶液进行1:10稀释。您可以使用ddH 2 O或目标溶液进行稀释。如果目标溶液非常精确地定义，则最好将其用于稀释以保持条件不变（因为ddH 2 O将改变/稀释溶液）。避免将SYBR Green II暴露在强光下。
吸取450 µl目标溶液到两个1.5 ml试管中。一次96孔板测量中，您可以拥有许多感兴趣的解决方案。一世。e。，许多双1.5毫升试管。可以在一个96孔板中最多使用7种感兴趣的解决方案（例如，见图1）。

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图1 。96孔板的示例，其中有7种不同的目标溶液（以不同的颜色突出显示）和3次重复的病毒复制（带有无病毒的背景对照），均使用RNase和不使用RNase进行测量。ř OWS A和H，且将列1和12被保留为空。

将4.5 µl先前稀释的SYBR Green II加入两个1.5 ml试管中。
添加4.5 微升的RNase A到1.5ml试管中的一个以10微克/毫升的最终浓度。最好使用高浓度原液，以消除对目标溶液的缓冲作用。我们在150 m M NaCl中使用预稀释的1 mg / ml RNase储备液。e。，在100 µl目标溶液中加入1 µl RNase。加入4.5微升150mM NaCl的溶液而不RN 一知的到另一个管，以保持离子浓度相同。
混合1.5 ml试管孔，然后将100 µl移液到96孔板的四个相邻孔中。将盘子放在冰上。请勿使用A和H行以及1和12列，因为板边缘的邻近可能会影响测量。见图1 FO 为r的例子。避免气泡。避免它们的最简单方法是使用反向移液进行混合，然后将液体放入孔中。在反向移液中，将移液器筒完全向下压，然后再将吸头内的体积调整为一定值，从而在混合溶液时在吸头内产生额外的体积。然后，体积仅达到第一个步骤中吸取了很好的下卷吸前等（有关详细信息，请参阅例如良好的实验室移液指南https://assets.thermofisher.com/TFS- 资产/ LSG /brochures/D16542.pdf。）
在溶液的三个第一孔中各加入1 µg病毒，并在第四孔中不加病毒，以测量溶液的背景荧光。较低的病毒量（至少低至0.5 µg）也可能适用。但是，如果感兴趣的溶液包含引起背景荧光的分子（例如本例中的BSA），则信噪比可能会很低，结果可靠性也会降低。另外，最好使用浓缩的病毒原液，以使将病毒添加到缓冲液中不会过多改变化学浓度。另一方面，过于集中的库存可能会增加移液误差。最佳病毒原种浓度约为1 µg / µl，即。e。，则每孔将添加1 µl病毒储备。
混合井。避免气泡。最简单的方法是使用8通道多移液器和反向移液器。
将板放在冰上，盖上铝制对开纸，然后转移到荧光板读取器上。
样品准备简述：
在两个1.5 ml试管，试管A和试管B中取450 µl目标溶液。将试管放在冰上。
在试管A和B中加入4.5 µl预稀释的1,000x SYBR Green II 。
从1 mg / ml的储备液中仅向管B中加入4.5 µl RNase A，至终浓度为10 µg / ml。
仔细混合两个试管，然后将100 µl溶液从每个试管中转移到四个相邻的孔中，即。e。，总共8口井。
吸取1 µg病毒到从试管A转移的3个第一个孔中，使第四个孔中没有病毒。对从具有RNase A的试管B转移的孔进行相同的操作。
充分混合，避免气泡。避光，放在冰上并转移到测量设备。

荧光测量
使用适当的过滤器准备测量规程以测量SYBR Green II。对于Perkin Elmer 2030多标签读取器Victor X4，使用CW灯泡过滤器F485和发射过滤器F535。使用14,592（或类似值约15,000）的CW-Lamp能量，计数时间为1秒。使用“用户定义”的测量高度-选项为13 mm，板类型为“通用8x12尺寸板”。保存该协议供以后使用。
标记要测量的孔，测量每个板90次（使用90次重复，两次重复之间的间隔为2分钟，总共需要3小时的测量。要使用其他总测量时间，请相应地调整“测量每个板”的字段）重复之间的延迟为0 s。预运行协议并确定一轮测量需要多长时间。要每两分钟测量一次孔，请从120 s中减去一轮测量所需的时间，然后将结果放入“重复之间的延迟”字段中。例如，如果您在实验中测量孔的时间需要30 s，请从120 s中减去该时间，并将得到的90 s放入“重复之间的延迟”。这样，读板器在第一轮测量后等待90 s，然后开始进行下一次测量，因此，每两分钟精确测量一次。请注意，在更改测量中的孔数时，需要相应地调整“重复之间的延迟”。
将读板器预热至+37°C或您要测量的任何其他温度。读板器需要一些时间进行加热，因此在开始准备样品和板之前先进行加热。
将先前准备好的印版放在有盖的印版读取器内部，但不要放入铝制折页。
启动协议。

数据处理
将数据导出到Excel。
从每个相同时间的溶液的荧光减去病毒在每个时间点的荧光背景。对所有三个重复执行此操作。
计算三个重复的平均值。计算平均值的标准偏差和标准误差。
将数据绘制到图形中。

数据分析

绘制图表后，首先应比较使用和不使用RNase的相同溶液的结果。没有RNase的荧光呈现出源自空的和膨胀的颗粒的荧光。带有RNase的荧光表示源自膨胀颗粒的荧光，带有和不带有RNase的条件之间的差异源自空衣壳。另外，应在病毒存储缓冲液中或在该病毒的另一个稳定环境中进行测量，以验证未修饰病毒的稳定性状态，这将导致荧光量降低。在一种溶液中比较有无RNase的测量结果后，还可以比较不同溶液之间的结果。至少可以比较不同病毒状态的比例。参见图2所示为监测稳定病毒（仅少量增加荧光），病毒引发（增加荧光并且仅使用RNase处理仅减少信号）和病毒开放（增加荧光但添加RNase后荧光损失）的测量示例。

在比较绝对荧光值时，必须记住，SYBR Green II的荧光强度可能会受到周围条件的影响。为了验证病毒体不同状态的比例份额，建议使用其他方法，例如用TEM或cryo-EM进行负染色。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902920--1327 Visa Ruokolainen 809471 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.三种情况的示例：病毒或多或少保持不变的保护性条件（黑色曲线），病毒主要转化为引发和扩展的中间形式的引发条件（蓝色曲线）以及病毒释放RNA的开放条件（红色曲线）。对于每种情况，由于RNase不能进入已涂底漆的或完整的颗粒内部，因此虚线下方的荧光来自膨胀的粒子，而当RNase消除荧光时，来自实线和虚线之间的荧光源自外部基因组。

笔记

根据病毒纯化的可重复性，不同批次的纯化病毒可能会显示不同程度的病毒启动和打开。特别是，我们观察到CsCl 纯化的病毒批次比蔗糖纯化的变异性更大。未经纯化的培养物上清液包含几种污染物，这些污染物可能会增加背景荧光并降低结果质量，并且它们的病毒浓度也可能太低。由于上述原因，请始终使用一些众所周知的控件来验证新一批病毒的可用性。

致谢

我们感谢于韦斯屈莱大学的Jane和Aatos Erkko 基金会和博士学校的资助，以及原始论文的作者（Ruokolainen et al。，2019）为引入该协议的工作做出了贡献。我们还要感谢Marjomäki 组的所有成员为工作中使用的不同肠病毒的生产和纯化做出的贡献。

利益争夺

本文作者没有相互竞争的利益。

参考文献

Myllynen，M.，Kazmertsuk，A。和Marjom ä KI，V。（2016）。回声病毒的一种新颖的开放性和感染性形式1. J Virol 90（15）：6759-6770。
Ruokolainen，V.，Domanska，A.，Laajala，M.，Pelliccia，M.，Butcher，SJ和Marjomaki，V.（2019）。细胞外白蛋白和内体离子会引发肠道病毒颗粒脱膜，可通过脂肪酸饱和来预防。J Virol 93（17）。
塔海尔，T. J.，Groppelli ，E.，霍格尔，JM和罗兰兹，D. J.（2010）。小核糖核酸病毒。于：Johnson ，J.（E d。）。在：非包膜病毒进入细胞。《微生物学和免疫学的最新话题》，第343卷。施普林格，柏林，海德堡。