材料和试剂

1. 移液器吸头（Tarsons ，目录号：521020,521010,521000）

2. 50 ml 组织培养瓶（Falcon，目录号：353108）

3. 细胞刮板（Falcon，目录号：353086）

4. 聚丙烯锥形管，50 ml（Falcon，目录号：352070）

5. 1.5 ml微量离心管（Falcon，目录号：500010）

6. 0.2 µm注射器驱动的过滤器单元（Millipore，目录号：SLGP0033RS）

7. 石英比色皿[10毫米，1 毫升容量]（Optiglass ，目录号：MCQ-254）

8. 薄纸

9. 26针

10. 10毫升注射器

11. 培养皿

12. RAW 264.7细胞（ATCC ，目录号：TIB-71）

13. 小鼠骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）（从BALB / c小鼠中分离）（有关详细信息，请参见食谱）

14. 多色利什曼原虫（MHOM / IN / 1983 / AG83）

15. DMEM介质（Gibco，目录号：11885-084）

16. M199培养基（Gibco，目录号：12340-030）

17. FCS（Gibco，目录号：10082-147）

18. 抗生素溶液，100 x （Himedia ，目录号：A001A）

19. 蛋白质测定染料试剂浓缩液（Bio- R ad，目录号：5000006）

20. 1 mM NAD（P）H（Santa C ruz，目录号：sc-202725）

21. 2 mM 6-磷酸葡萄糖（Santa C ruz，目录号：sc-210728）

22. 1 U 6磷酸葡萄糖脱氢酶（Sigma - Aldrich，目录号：G-6378）

23. 25 µM血红素（Sigma - Aldrich，目录号：51280）

24. 盐酸Biliverdin （Sigma - Aldrich，目录号：30891）

25. 氯化钠（MW = 58.44 g / mol）

26. 娜2 HPO 4 （MW =141.96克/ mol）的

27. 氯化钾（MW = 74.55 g / mol）

28. KH 2 PO 4 （MW = 136.08 g / mol）

29. K 2 HPO 4 （MW = 174.18 g / mol）

30. 氯化镁2 （MW =95.211克/ mol）的

31. 蔗糖（MW = 342.29 g / mol）

32. 柠檬酸钠（MW = 258.06 g / mol）

33. 甘油

34. 70％乙醇

35. 磷酸盐缓冲液/缓冲液（pH 7.4）（有关详细信息，请参见食谱）

36. 含有2 mM MgCl 2 和完全蛋白酶抑制剂的0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）（请参见食谱）

37. 0.6 M蔗糖溶液（请参阅食谱）

38. 含有10％甘油的0.1 M柠檬酸钠缓冲液（pH 5）（请参阅食谱）

39. 2 mg大鼠肝脏胞质蛋白（请参阅食谱）

设备

250毫升瓶
-80 °C冷冻室
无菌剪刀和镊子
可变体积移液器（Tarsons ，目录号：030050、030040、030020、030000）
孵化器（Thermo Scientific）
高压釜
离心机（Thermo Scientific）
超速离心机（Thermo Scientific，型号：WXUltra90）
层流气流（NEO 设备，型号：LX80）
Vortex（Tarsons ，目录号：3020）
pH计（Sartorius，型号：PB-11）
磁力搅拌器（Tarsons ，Ç atalog号：6030）
分光光度计偏振计（Jasco，Ç atalog号：V-630）

程序

含有HO-1酶的微粒体级分的制备
在指定的时间点（0、0.25、0.5、1、2和4小时）用带有寄生虫与巨噬细胞比例（10：1）的多形利什曼原虫前鞭毛虫感染T25烧瓶中的80％融合巨噬细胞（RAW 264.7或BMDM ）。
后培养，丢弃媒体并小心地用1ml的PBS溶液洗涤细胞，并通过将所有烧瓶在冰上整个被执行的步骤。
向每个烧瓶中加入1 ml磷酸钾缓冲液，然后用刮刀轻轻刮擦细胞。
将刮下的细胞转移到通过置于冰上预冷的50 ml F alcon中。
再添加2 毫升磷酸钾缓冲液。
在冰上孵育细胞15分钟。
短暂地以80％的振幅将细胞悬液超声处理，每5分钟间隔15 s，在冰上保持3次。
将蔗糖溶液添加到细胞裂解物中，以获得最终浓度为0.25 M的蔗糖。
在4 °C下将溶液以1,000 xg离心10分钟。
注意：沉淀将包含核。

在4 °C下以12,000 xg 离心上清液15分钟。
注意：沉淀中将包含线粒体。

在1 超速离心上清液05,000 x g 在4 °C下放置1小时。
丢弃上清液。
注意：沉淀是含有HO-1酶的微粒体级分。

将沉淀重悬于500 µl 0.1 M磷酸钾缓冲液中。
存放于-20°C直至使用。

蛋白质浓度的估算（Bradford，1976）
配制6份牛血清白蛋白（BSA）稀释液（10 mg / ml），并在995 µl稀释的Bradford分析试剂（1：5）中一式两份，配制0至50 µg的蛋白质，并从每份中分别添加5 µl将测试样品一式三份稀释在995 µl稀释的Bradford分析试剂（1：5）中。
轻轻颠倒2至3次，混合所有样品。
将其在室温下孵育5分钟，并在595 nm处读取吸光度。
注意：在室温下，准备好的溶液不要放置超过1小时。

分离含有胆绿素还原酶的大鼠肝脏胞质组分
安乐死一只Sprague D awley 大鼠。
通过肝门静脉原位向肝脏灌注0.9％NaCl溶液，直至完全变白。
切除变白的肝脏，并用剪刀将其彻底切碎。
使用组织分析仪（Bio - R ad）在5 ml 0.1 M柠檬酸钠缓冲液中均质化肝脏样品
将匀浆液在10,000 xg 下于4 °C 离心20分钟。
小心吸出上清液，然后在4 °C下以1 05,000 xg 超速离心1小时。
上清液用作biliverdin还原酶的来源。
通过测量在464nm（胆红素）和670nm（胆红素）上的吸光度评估从胆绿素产生的胆红素的量，来测试所获得的一部分上清液的胆绿素还原酶活性。将所得的上清液中的5 µg蛋白与10 µM biliverdin（Sigma）和400 µg / ml牛血清白蛋白（BSA）在100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中于37 °C 孵育5分钟， 200微升通过添加1mM NADPH来引发反应。上清液的蛋白质浓度为约10mg / ml。
储存在-80 °C 直至使用。
注意：请尽快使用溶液，因为酶在储存后会失去活性。

血红素加氧酶1活性的评估
孵育600微粒体蛋白的微克用含有反应混合物1mM的NAD（P）H，2 mM葡萄糖-6-磷酸，1U的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（西格玛- Aldrich公司），25μM氯高铁血红素，2毫克的RA 吨肝细胞溶质蛋白和100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）。
用磷酸钾缓冲液（pH 7.4）将最终体积调节至400 µl。
放置管中的d 在37柜1个小时℃下。
1小时后，将试管放在冰上2分钟以终止反应。
通过分光光度计测量胆红素浓度来确定HO-1活性。

分光光度法检测胆红素
通过464和530 nm之间的吸收差异（消光系数，BL为40 mM -1 cm -1 ）确定胆红素浓度。
在每小时每毫克微粒体蛋白形成的BL皮摩尔中表达HO-1活性（图2）。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902825--1326 Anindita Ukil 734573 \ Figs jpg \图2.jpg

图2 。在指定的时间段（0-4小时）内，测量了多发利什曼原虫感染的RAW 264.7巨噬细胞的HO-1活性

数据分析

计算两个OD之间的差

A = A 464 – A 530

孵育1小时。

因此，ΔA= A h -1

路径长度= 1厘米

因此，使用兰伯特比尔斯定律[A = εcl ];

[其中c =浓度，ε= 消光系数，胆红素（BL）的40 mM -1 cm -1 ，l =路径长度，1 cm]

h -1 /（mM -1 cm -1 x cm）

h -1 /毫米-1

pmol µl -1 h -1 [1 mM = 10 3 皮摩尔µl -1 ]

反应总体积为400 µl

因此，pmol h -1

pmol h -1

添加的蛋白质量为600 µg。

因此，pmoles的Billirubin（BL）（毫克蛋白）-1 h -1

pmol 的Billirubin （BL）（毫克蛋白）-1 h -1

菜谱

磷酸盐缓冲液/缓冲液（pH 7.4）
在灭菌的1 L 瓶中添加8 g NaCl（MW = 58.44 g / mol）
添加1.44 g Na 2 HPO 4 （MW = 141.96 g / mol）
加入0.2 g 氯化钾（MW = 74.55 g / mol）
加入0.24 g KH 2 PO 4 （MW = 136.08 g / mol）
将试剂完全溶解在约800 ml蒸馏水（dH 2 O）中
使用1 M HCl或1 M NaOH 将pH调节至7.4 （根据需要）
用灭菌蒸馏水补足最终体积至1 L
通过在15 磅压力（121 °C ）下高压灭菌15分钟来消毒溶液
将溶液储存在4 °C
包含2 mM MgCl 2 和完全蛋白酶抑制剂的0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）
在灭菌的250毫升瓶中添加2.61克KH 2 PO 4 （MW = 136.08 g / mol ）
加入2.04 g K 2 HPO 4 （MW = 174.18 g / mol）
加入28.56 mg的MgCl 2 （分子量= 95.211 g / mol）
将试剂完全溶解在约120 ml无菌蒸馏水（dH 2 O）中
使用1 M HCl或1 M NaOH将pH调节至7.4（根据需要）
用无菌蒸馏水补足最终体积至150 ml
如上所述通过高压灭菌来消毒溶液
将溶液储存在4 °C
在实验当天，等分25毫升溶液，并在使用前添加完全的蛋白酶抑制剂。

0.6 M蔗糖溶液
在灭菌的250 毫升瓶中将80.53克的dH 2 O 加入20.53克的蔗糖（MW = 342.29 g / mol）
完全溶解试剂
补足最终体积至100 ml，并按上述高压灭菌法灭菌
储存在4 °C
0.1 M柠檬酸钠缓冲液
将2.58 g柠檬酸钠（MW = 258.06 g / mol）添加到250 ml灭菌瓶中的80 ml灭菌dH 2 O中
试剂溶解合作mpletely
使用1 M HCl或1 M NaOH（根据需要）将pH调节至5.0
加入10毫升甘油溶液
补足至100 ml，并按上述高压灭菌法灭菌
储存在4 °C
大鼠肝细胞溶质
安乐死一只Sprague D awley 大鼠
通过肝门静脉原位灌注0.9％NaCl溶液直至肝脏完全变白（Wen 等，2012）
切除变白的肝脏，并用剪刀将其完全切碎
在5 ml 含10％甘油的pH值为5 的0.1 M柠檬酸钠缓冲液中匀浆
离心所得匀浆在10,000 ×g下于20分钟
收集得到的上清液caref ully 在1米超速离心机05000 ×g离心1个小时
仔细收集获得的上清液，并等分保存在-80 °C 下使用
注意：尽早使用所制备的酶，使其在储存时逐渐失去活性。

骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）
安乐死鼠标
将鼠标置于仰卧位置，并通过将四只腿穿过踝关节下方的鼠标爪垫来固定鼠标
用70％的乙醇彻底喷洒小鼠的腹部和后腿
在每条后腿的顶部做一个切口，并用无菌剪刀和镊子将皮肤向外拉，露出肌肉
用剪刀从骨头上去除最大的肌肉和结缔组织。小心地隔离整个股骨和胫骨，而不会割伤骨头末端或折断骨头
借助薄纸清洁骨头上所有附着的组织
借助镊子将骨头转移到含有70％乙醇（EtOH）的P etri皿中一分钟，然后在细胞培养罩中风干约5分钟
小心地切断孤立的骨头的两端，以免骨头碎裂
注意小号：

用镊子固定股骨或胫骨。将剪刀放在关节上方，以防止骨头破裂。转动骨头并重复该过程。
不要让骨头的切口接触任何东西，因为这会导致骨髓污染。
通过将一根26号针头插入连接到10 ml注射器的26 ml规格的注射器中，将其冲洗到50 ml Falcon管中，该注射器在两种类型的骨头的膝盖侧均装有1 x PBS（含抗生素溶液）。使PBS穿过骨骼，直到骨骼的颜色由红色变成白色，表明骨髓大部分已被排出
将骨头丢入空的培养皿中
注意小号：

切割骨头后，应尽快对每个骨骼执行这些步骤。
切勿在切割和冲洗之间放下骨头。
在4 °C 下以1,500 rpm离心收集的细胞悬液10分钟
娲再次SH细胞沉淀用1 X PBS
将细胞重悬于RPMI 1640，补充有100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素，10个％FCS，和25ng / ml的GM-CSF，并在5％CO孵育2 ，95％湿度，在37 ℃下
在第4天，将丢弃培养基，并添加新培养基，其中包含100 U / ml青霉素和100 µg / ml链霉素，10％FCS和25 ng / ml GM-CSF
在第6天，将获得BMDM手机以供使用

致谢

这项工作得到了生物技术部（BT / HRD / NBA / 38/03/2018），大学教育资助委员会[F. 6-10 / 2016（IC）]，科学技术部（SB / SO / BB-0055 / 2013），西孟加拉邦生物技术部[221 / BT（Estt ）/ RD-40 / 2014]和具有卓越潜力大学II（授予UGC / 148 / UPE / ST1）。MB和SS从大学教育资助委员会（新德里）获得了研究金。该研究得到印度新德里科学与工业研究理事会的支持。

利益争夺

作者没有竞争利益。

伦理

根据动物控制和监督委员会（印度新德里）提供的指南进行动物维护和实验。该方案已获印度Bose研究所的机构动物伦理委员会（IAEC）批准（IAEC批准号IAEC / BI / 82/2017）。

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