材料和试剂

移液器技巧
剃刀片
巴斯德移液器
小号terile 注射器过滤器（Millipore公司，目录号：SLGV033RB，或等效）
50 ml无菌无菌锥形管（Corning，目录号：430921，或等效产品）
乙二胺四乙酸（EDTA ）（Sigma-Aldrich ，目录号：E9884 或等效的产品）
聚乙二醇（PEG）6000（Sigma-Aldrich ，目录号：81255 或同等产品）
氯化钠（NaCl ）（Sigma-Aldrich ，目录号：S5886 或同等产品）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516或同等产品）
Na 2 HPO 4· 12H 2 O
NaH 2 PO4 · 2H 2 O
氢氧化钠
考马斯亮蓝G-250 （Sigma-Aldrich ，目录号：1.15444 或同等产品）
小鼠抗RSV 核衣壳单克隆抗体（由浙江大学吴建祥教授提供）
山羊抗小鼠IgG HRP偶联物（Invitrogen，目录号：31430或同等产品）
0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.5（请参阅食谱）

设备

搅拌机（飞利浦，目录号：HR2116或同等产品）
1 L玻璃烧杯
冷冻离心机仪（Eppendorf，目录号：5810R）
4°C 冰箱（Haier，目录号：HYC-391或等效产品）
移液器（Eppendorf，目录号：R42223G或类似产品）
制冰机（Phcbi ，目录号：SIM-F140AY65-PC或同等产品）
精密天平（Sartorius，型号：Practum313-1CN或同等产品）
超速离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Optima XPN-90）
适用于70Ti转子的26.3 ml超清晰管（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号355618）
适用于90Ti转子的超清晰10.4 ml管（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号：355603）
适用于SW32.1转子的10毫升超清管（Beckman Coulter，目录号344061）
Formvar 和碳涂层的200目镍栅（电子显微镜科学，目录号：FCF200-Ni）
透射电子显微镜（日立，型号：HT-7700）
ChemiDoc 触摸成像系统（Bio-Rad，目录号：1708370）

程序

使用携带RSV的Laodelphaxstriatellus 将病毒传播到健康水稻幼苗。在水稻幼苗上接种48小时后，将水稻植株在温室中于30 °C 的光照（16 h）和2 6 °C 的黑暗（8 h）中维持60天。收集了显示出典型叶条纹症状的受RSV感染的稻叶（图1A）。
将0.1 M磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.5，含有0.01 M EDTA（PB-EDTA）和搅拌器保持在4° C 下。
将50 克受RSV感染的米叶用剃须刀切成小块（约2厘米），然后在冷冻搅拌机中的800毫升冷冻PB-EDTA中研磨5分钟。
通过两层纱布过滤匀浆以去除大碎屑。
在4°C下以8,000 x g的速度离心过滤的提取物20分钟，以去除细小的细胞碎片。
离心过程中，根据上清液的体积称重PE G 6000粉末（使用前将PEG 6000研磨成细粉）和NaCl 。
将上清液转移至灭菌并预冷的1 L玻璃烧杯中。
将PEG 6000和NaCl 缓慢加入到玻璃烧杯中，直到最终浓度为6％PEG（w / v）和0.1 M NaCl 为止。将混合物在4°C下搅拌4小时，然后将其在4°C下放置过夜。
使用冷冻离心机中的角向转子在4°C下以8,000 x g的速度将该混合物离心20分钟，以沉淀RSV 病毒颗粒。
将沉淀重悬于8 ml 0.01 M PB-EDTA中，并在4°C下以8,000 x g 再次离心10分钟。
将上清液转移到干净的预冷离心管中。重复步骤9两次。
在用于70Ti转子的预冷超速离心管中合并这三种上清液，并在4°C下以150,000 x g 离心2 h 。弃上清，重悬沉淀在6 ml的0.01M的PB。
加4毫升20％将甘油溶液放入干净的超透明离心管中，使90Ti转子形成甘油垫。
小心地将重悬的沉淀溶液放在甘油垫上，并在4°C下以150,000 x g 离心2 h。
离心后（图1B），弃去上清液，并通过反复移液用4 ml PB重悬沉淀。
准备10％，20％，30％和40％的蔗糖溶液。2 米升40％蔗糖溶液中首先加入到超离心管中的底部ND然后缓慢添加2米升每个的30％，20％和10种％蔗糖溶液，依次，上的顶部1 0％的蔗糖溶液用移液器。
小心地将重悬的沉淀溶液置于蔗糖密度梯度为10-40％的SW32.1转子专用离心超速离心管内，并在70,000 x g 下于4°C 离心2 h。
将离心管放在光源下，两个单独的条带可见（图1C，M和B ）。山口分别LECT两个频带和分析通过SDS-PAGE（图2A），这些Western印迹（图2B）和TEM（图3）。将甘油添加到纯化的病毒体样品（M带）中，以使最终浓度达到30％。将样品储存在-70°C直至进一步使用。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902947--1331陶小荣777201 \ Figs jpg \图1.jpg

图1. 通过超速离心从受RSV感染的稻叶中纯化RSV。A.受RSV感染的大米样品显示出典型的条纹症状。B. 通过20％甘油垫超速离心沉淀RSV 病毒颗粒。带有RSV 病毒体的深绿色沉淀物位于离心管的底部。C. 通过10-40％蔗糖密度梯度超速离心纯化RSV 病毒颗粒。显示了带有RSV 病毒体的中音带和底带。M，中频段；B，底带。

数据分析

SDS页面
M和B个波段的共分别llected和分析通过SDS-PAGE（图2A）。将来自M和B波段的少量样品分别与上样缓冲液混合，并在95°C下煮沸10分钟。将这些样品在10％SDS-PAGE凝胶的泳道中以120 V电压进行50分钟电泳分离。在成像前，将凝胶用0.5％考马斯亮蓝G-250 染色。

免疫印迹
通过蛋白质印迹进一步分析M和B成分（图2B）。通过电泳通过10％SDS-PAGE分离后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用1：5,000（v / v）稀释的小鼠抗RSV 核衣壳单克隆抗体和结合了山羊抗小鼠IgG的探针探测印迹使用HRP。使用ChemiDoc 触摸成像系统可以看到印迹。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902947--1331陶小荣777201 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析M和B带产物。A.以10-40％的蔗糖密度梯度离心后，分别收集M和B条带，并在10％SDS-PAGE凝胶中通过电泳进行分析。该凝胶被染色考马斯蓝G-250。与用于预测RSV大小的条带核衣壳蛋白（NP）是表示用箭头。乙。使用针对RSV NP的单克隆抗体对M和B带进行Western印迹分析。箭头指示与RSV 核衣壳蛋白（NP）相对应的条带。

透射电子显微镜
对于TEM，将纯化的RSV样品以1:50（v / v）0.01 M PB稀释，然后（每个样品5 µl）放置一个甲醛和碳涂层的200目镍网格。一分钟后，通过用滤纸接触网格的边缘，将样品从网格中取出。然后将网格用1％乙酸铀酰溶液染色2分钟。除去乙酸铀酰溶液后，在电子显微镜下检查栅格。RSV 病毒体是仅M带样品（图3）中检测到。

图3. 显示RSV 病毒粒子的TEM图像。RSV v irions 是从RSV感染的水稻植物使用上述方案，用乙酸双氧铀溶液染色纯化，然后检查并在电子显微镜下成像。箭头指示filamentou 小号RSV virio 纳秒。刻度条= 50纳米。

笔记

为避免病毒粒子降解，每个纯化步骤均应在约4°C下进行。纯化的病毒体样品应立即保存在-70°C下。
ģ lycerol 可以在电子显微镜下影响RSV可视化。我们建议在不添加甘油的情况下将新鲜纯化的RSV用于TEM。

菜谱

0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.5
在1 升蒸馏水和消毒水中的21.2 克Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 和2.21克NaH 2 PO 4 · 2H 2 O
使用NaOH将pH值调整为7.5
将溶液储存在4 °C的冰箱中

致谢

我们感谢通州教授（江苏省农业科学院植物保护研究所）提供受RSV感染的水稻植物。这项工作得到了国家自然科学基金（31925032、31630062和31870143），中央大学基础研究基金（JCQY201904）的支持，并由宁波大学的KCWong Magna基金赞助。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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