材料和试剂

猎鹰3毫升移液器（Corning，目录号：357524）
6英寸棉头涂抹器（VWR，目录号：89031-270）
VWR ® 微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
VWR ® 的Superfrost ® 此外微型滑动（VWR，目录号：48311-703）
Polycin ® Ophth almic软膏，USP （百利高，目录号：NDC 0574-4021-35 ）
吸收剂工作台垫（VWR，目录号：82020-845）
Kimwipes （Fisher Sci entific ，目录号：06-666）
猎鹰® 48孔透明平底板（Corning，目录号：353078）
35 x 10 mm组织培养皿（Corning，目录号：353001）
SecureSeal TM 成像垫片（Grace Bio-Labs，目录号：654006）
22 x 22毫米（1.5号）微盖玻片（VWR，目录号： 48366-227）
成年（> P21）雄性和雌性C57BL / 6J小鼠（JAX，目录号：000664）
美国药典Fluriso TM 异氟烷（VetOne ，目录号：NDC 13985-528-60 ）
氯胺酮（或当地法规批准的类似物质）
赛拉嗪（或您当地法规批准的类似品）
盐酸丁丙诺啡（或当地法规批准的类似品）
刷新眼泪® 润滑剂眼药水（Allergan，目录号：NDC 0023-0798-01或类似产品）
普罗卡因盐酸盐眼药水，美国药典（Sandoz，目录号：NDC 61314-016-01）
霍乱毒素B亚基（CTB），Alexa的氟TM 555偶联物（热费舍尔，目录号：C34776）
10x磷酸盐缓冲盐水（Thermo Fisher，目录号：AM9624）
16％多聚甲醛溶液（Fisher Scientific ，目录号：50-980-488）
FocusClear TM （CelExplorer ，目录号：FC-101）
MountClear TM （CelExplorer ，目录号：MC-301）
Triton TM X - 100（Sigma，目录号：X100）
非特异性山羊血清（Thermo Fisher，目录号：16-210-064）
抗RBPMS，豚鼠（Phospho Solutions，目录号：1832-RBPMS）
Anti-Guinea Pig-Alexa Fluor 647（Thermo Fisher，目录号：A21450）
的ProLong ® 黄金抗淬灭封固（赛默飞世，目录号：P36934）
平面安装阻塞缓冲器（请参见配方）

设备

手术显微镜（WPI，目录号：PSMB5N）
实验室立体显微镜（VWR，目录号：10836-004）
热珠灭菌器（FST，目录号：1800050）
鼠标加热垫（Stryker，目录号：TP600 / 700）
带感应箱的台式异氟烷麻醉系统（哈佛仪器，目录号：72-6468）
杜蒙＃5直钳（FST，目录号：11251-10）
杜蒙＃7弯曲钳（FST，目录号：11271-30）
Dumont＃N5镊子交叉作用Inox细尖尺寸.05 x .01 生物学尖（Roboz Surgical，目录号：RS-5020）
汉密尔顿注射器（Hamilton Company，5μl ，700 系列，目录号：7634-01）
汉密尔顿33号针头（汉密尔顿公司，目录号：7803-05，33规格，点4 0.375英寸）
Vannas 弹簧剪刀-2.5毫米切削刃（FST，目录号：15000-08）
手术剪刀（FST，目录号：91402-14）
蔡司880 LSM共焦显微镜（蔡司）

软件

斐济ImageJ（https://imagej.net/Fiji）
Adobe Photoshop（https://www.adobe.com/）

程序

玻璃体内AAV2注射
根据您的实验室和我们的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的规程或特定国家/地区的规定对小鼠进行麻醉。对于玻璃体内注射，使用桌面诱导盒和鼻锥施用异氟烷就足够了。
虽然动物麻醉下，一定要保持自己的眼睛湿润了在任何时候通过应用刷新泪® 润滑滴眼液需要（每只眼睛一滴每隔5分钟就足够了）。
注意：为防止角膜的过程中玻璃体内注射晒出与ONC手术宽松申请刷新泪® 根据需要润滑滴眼液。

麻醉后，将鼠标移至手术范围并连接鼻锥（确保异氟烷在流动）。
向每只眼睛滴入1滴Proparacaine（或类似的局部麻醉药）以阻止局部反射。等待〜1-2分钟，然后轻轻触摸结膜以确认麻醉深度。
倾斜鼠标的头部，使目标眼睛面向示波器（图1A）。使用棉签涂抹器擦去多余的液体。
使用＃5镊子，在上下眼睑之间滑动尖端，使眼球突出于眼窝，并轻轻将结膜捏到角膜缘下方约1 mm （图1B）。
在用镊子稳定眼球的同时，用一只手拿起预装的5μlHamilton 注射器，相对于视神经成60 °角，小心地将巩膜针〜1 mm（斜面朝向晶状体）穿过巩膜角膜缘下方约1毫米进入玻璃体腔（图1C）。由于晶状体占据了玻璃体腔的大部分，因此应注意避免刺穿晶状体。
注意：效价≥1 x 10 12 GC / ml的纯化的体内AAV2级抗体应用于有效转导RGC。

用食指轻轻推动柱塞以注入1μl 病毒。
注意：在视神经压伤之前检查镜片。如果有白内障，则应排除眼睛。

注射后，将针头留在玻璃体腔中约15-20秒，以防止泄漏，然后慢慢取出。
注意：如果液体开始从注射部位回流，则可能注射了太多病毒，并且可能无法将眼睛从以后的分析中排除。

取下镊子，然后闭上眼睑，将眼睛轻轻地放回插槽中。
适用的慷慨量Polycin ® 在角膜和喷射区域眼用软膏（或类似抗生素软膏）。
翻转鼠标并根据需要在对侧眼中重复注射。
将动物放到加热垫上以使其完全康复（约2-3分钟），然后再转移回其家中笼子。
饲养动物2周或优化长度，以使病毒最大表达，然后进行视神经挤压。
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图1. AAV2玻璃体内注射。A. 将麻醉的小鼠转移到手术镜上，并倾斜头部，使目标眼面向镜。在每只眼睛上滴入一滴Proparacaine，以阻止局部反射，并用棉签涂抹器清除多余的液体。B. 用镊子捏住角膜缘正下方的结膜，并保持眼睛稳定。C. 用一只手将预装的汉密尔顿注射器以60 °角插入角膜缘下方约1 mm处，进入玻璃体腔，然后用食指压下柱塞轻轻注入1μl 病毒。取下针头之前，请将其保持在适当的位置约15-20 s，以防止泄漏和使病毒均匀分布。

视神经挤压手术
深麻醉话筒通过异氟烷诱导和腹膜内（IP）或皮下（SC）注射氯胺酮（100 E 毫克/ ķ 克）/ 符合您实验室和机构IACUC协议或当地法规的甲苯噻嗪（20 mg / k g）（或类似的获批混合物）
注意：为防止干燥角膜过程中玻璃体内注射了荷兰国际集团和ONC手术宽松申请刷新泪® 根据需要润滑滴眼液。

将鼠标移至手术范围，并向每只眼睛滴入1滴普罗卡因（或类似的局部麻醉药）。等待〜1-2分钟，然后通过后肢捏捏确认麻醉深度。
确保麻醉深度后，稍微倾斜鼠标头，使目标眼睛面向外科医生。
用湿的棉签涂抹器将所有头发和多余的液体从眼睛刷去。
在开始外科手术之前，应使用热珠灭菌器对外科工具进行灭菌。灭菌后等待几秒钟，以使工具冷却。
在上下眼睑之间滑动＃5镊子的尖端，使眼睛从插座中突出。
用另一只手捏住＃7弯曲镊子沿球体的上颞边界结膜，在组织中形成小折叠（这将防止切得太深并损害巩膜）（图2A）。
缩回＃5镊子并拿起弹簧剪刀，用弯曲的镊子保持眼球的抓握。
用弹簧剪刀，以褶皱为指导在颞上结膜上切一个1 mm的孔（图2A），然后用钝器解剖结膜，使孔变大（图2B）。
直到你有优越的肌肉的清晰视图（这可以是具有挑战性的，以确定，但重要的是防止眶窦的损伤）轻轻分开用钳子组织（图小号2C- 2 d）。
用您的优势手，将＃5镊子穿过新形成的开口，越过上肢肌肉，并小心地推开阻碍视神经的脂肪（图2E）。注意不要破坏任何血管，尤其是眼眶窦，否则腔中会充满血液并完全阻塞视神经的视野。
注意：在组织分离过程中可能会有一点点出血；如果是这样，请使用棉签擦拭血液。

视神经可视化并清除后，将Cross Action自闭合钳在眼球后2 mm的视神经周围打开位置插入，松开握持并稳定3秒钟以压碎（图2F）。这应该足以引起视神经轴突完全变性直至挤压部位，并导致RGC细胞大量死亡。
注意：小鼠的视网膜中央动脉（CRA）从眼球（OA）分支，而眼球非常靠近地球（May和Lütjen-Drecoll ，2002年）。如果您清除ON周围的组织并在球体后方2毫米处挤压，那么挤压不会阻碍视网膜的血液供应。

挤压后，打开和收回Cross Action自动关闭钳。
用镊子轻轻地使眼睛回到自然位置，然后闭上眼睑。
适用的慷慨量Polycin ® 在切口和角膜眼用软膏（或类似抗生素软膏）。
转动鼠标的头部，并重复对侧视神经实验计划。
手术后应按照实验室和机构的IACUC规程或当地法规管理盐酸丁丙诺啡（或类似的镇痛药）。
将小鼠放在加热垫上以使其完全康复（〜60分钟），然后再转移回其家中笼子。
按照实验室和机构的IACUC协议或当地法规的规定，每12-24 小时检查一次感染。
家鼠12天，然后进行CTB注射。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902757--1314 Michael Kapiloff 799095 \ Figs jpg \ Fig 2.jpg

图2.视神经挤压手术。A. 用镊子在地球的上颞边界捏结膜，在组织中形成小折叠。使用弹簧剪刀在后部以折叠的结膜为向导切开一个1毫米的孔。B. 用镊子直截了当地轻轻分离组织，以将孔扩大到2-3 mm。光盘。小心地推开任何阻碍视神经的脂肪，注意不要破坏眼眶窦。E. 一旦视神经被清除并可视化。F. 使用Cross Action自闭合镊子将视神经压在球体后2 mm处3秒钟。

再生视网膜神经节细胞轴突的CTB标记
将CTB-555（或所需的荧光团，500 µg）重悬于50 µl无菌PBS中，使其终浓度为10 µg / µl。
后12天挤压，麻醉小鼠，并相应地注入1 μ 上述CTB-555的升到每只眼睛玻璃体内地具体根据AAV2注射方案。
笔记：

为了防止从角膜中玻璃体内注射干燥和ONC手术宽松申请刷新泪® 根据需要润滑滴眼剂。
CTB-555应该与AAV2-GFP病毒载体一起使用。或者，根据AAV2报告基因，可以使用CTB-488或-647。
如Leon等人所述，可通过GAP43染色可视化再生神经元。（2000 ）。

组织解剖和视神经清除
根据您的实验室和机构的IACUC规程或当地法规，经心灌注灌注后14天将小鼠牺牲。
脱去固定的小鼠，并用手术剪刀去除眼睛和头部顶部周围的所有皮肤和头发（图3A）。
使用＃5镊子和弹簧剪刀，仔细解剖掉将球体连接到球窝的结膜，使其可以在轨道内自由移动。
轻轻地将球体拉向鼻腔以进入眼眶，并去除泪腺以及眼后部的任何脂肪，以露出视神经。
通过用弹簧剪刀将视神经尽可能靠近球体切开，使眼睛充满魅力，并转移至包含约500个孔的48孔培养皿中 μ升4％PFA。后修复1个小时在室温下（图小号3A- 3 B）。
1小时后，吸出PFA，并用1x PBS代替。眼睛可在4 °C的无菌1x PBS中保存12小时以上。
固定好所有眼睛后，继续进行平口解剖。
要隔离视神经，请先用大号手术剪刀切除后脑。
然后沿矢状（背）和鳞状（时间的）缝线手术剪小心切开和剥离经鼻颅骨以暴露皮质（F igure 小号3B- 3 C）。
用＃5镊子将嗅球从皮层中直截了当分离，然后将镊子滑到前脑下方，并从前向后轻轻抬起〜45 ° ，露出颅底的视神经（图3D）。
确保神经可以自由地滑过脑膜鞘并将大脑翻转出颅骨（图3E）。
注意：如果神经被卡住，请在切除大脑之前解剖掉脑膜。

在露出大脑下方的情况下，使用弹簧剪刀将神经切断到正好位于视交叉的上方（图s 3F- 3 G）。
如果需要，可以用弹簧剪刀将左，右视神经分开在as骨处。
神经传递到48孔培养皿的含〜300 μ 升4％PFA /孔和后固定1 ħ 在室温下。
固定后，除去PFA与移液管，并用〜100替换μ 升FocusClear TM 为≥3小时或直到视神经是完全透明的（狄克曼等人，2015;王等人，2019）
将SecureSeal TM 成像垫片放在干净的幻灯片上，以建立一个小腔室，以防止在安装时挤压神经。
置于腔室视神经，盖与MountClear TM 和盖玻片用22×22毫米的微型盖玻片。
注意：安装前，请确保在55 °C的水浴中加热MountClear TM 约30分钟。

通过平铺扫描和共聚焦显微镜在Z轴上进行堆叠，从粉碎部位到胫骨的完整清晰的视神经图像以20倍成像。堆叠的图像应以8 µm的间隔获取。
最大投影z-stack图像，并进行清晰的视神经再生的量化。

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图3.眼睛和视神经解剖。A. 用大号外科手术剪刀除去眼睛和头顶周围的皮肤和头发，然后用镊子和弹簧剪刀仔细解剖结膜，将球体连接到承窝，并在视神经进入球体时切断视神经。将眼睛转移到含有4％PFA的48孔培养皿中。B. 用大号外科剪刀剪掉后脑（实线），然后沿矢状和鳞状缝合线（虚线）浅切。C. 轻轻地将头骨（黑色星号）鼻翼剥离，露出皮质（红色星号）和嗅球（黄色星号）。D. 直截了当地将嗅球从皮层中分离出来，然后将镊子轻轻滑到前脑下方并抬起〜45 ° ，露出视神经（绿色箭头）。E. 要分离神经，请小心地将大脑从颅骨中翻转出来，以确保在移除之前神经可以自由地滑过脑膜鞘（如有必要，请解剖脑膜以防止视神经被抓住和撕裂）。F. 在暴露出大脑下方的情况下，G。切断了神经，使其恰好超出了神经干，并转移到含有4％PFA的48孔培养皿中。

平装解剖
在解剖范围内，将固定的眼睛转移到装有无菌1x PBS的35 x 10 mm组织培养皿中（图4A）。
用＃5镊子捏住角膜，保持眼球稳定，并用针在角膜缘上方钻一个小孔（图4B）。
用镊子捏住角膜，并用弹簧剪刀将新形成的孔作为接入点解剖（图4C）。
使用＃5镊子小心地从视网膜表面取下晶状体和所有残留的玻璃体，注意不要触摸视网膜表面（图4D）。
将＃5镊子滑入视网膜后方的视网膜下空间，并通过捏紧巩膜使球保持稳定。
将闭合的弹簧剪刀滑入视网膜下间隙，并在眼周周围移动它们，以使视网膜与RPE /巩膜完全脱离。
分离后，使用弹簧剪刀通过向视网膜中心进行4个均匀间隔的2-3 mm切口，将视网膜划分为相等大小的象限（图4E）。
轻轻地将视网膜滑出眼罩，然后转移到另一个装有无菌1x PBS的35 x 10 mm组织培养皿中（图4F）。
检查视网膜表面并清除所有残留的玻璃体。
注意：至关重要的是，必须从视网膜表面去除所有玻璃体，否则会干扰抗体染色。

使用切开的3 ml移液管将解剖的视网膜转移至包含1x PBS的48孔组织培养皿中（图s 4G- 4 H），然后进行平装免疫染色。

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图4.视网膜平面安装解剖和染色。A. 将固定的眼睛转移到含有新鲜1x PBS 的小型组织培养皿中。B. 用镊子稳定眼球，并在角膜缘上方用针在角膜上戳一个小孔。C. 使用新形成的孔作为接入点，用弹簧剪刀解剖角膜。在角膜缘下方切开，以确保睫状体和虹膜与视网膜分离。D. 用镊子轻轻取下晶状体和玻璃体。E.将镊子滑入视网膜下腔，并使用弹簧剪刀将视网膜与RPE /巩膜分离。通过在视神经头上形成4个均匀间隔的〜2-3 mm的切口，将视网膜分成四部分。F. 小心地将视网膜滑出眼罩，并用镊子去除视网膜表面上残留的所有玻璃体。G. 使用切割的3ml移液管，H。将解剖的视网膜（黄色箭头）转移到含有1x PBS的48孔培养皿中，并如下所述进行视网膜染色。I. 染色后，将视网膜神经节细胞的一面朝上移至干净的玻片上，并展开花瓣。用扭曲的KimWipe 清除多余的液体，注意不要触摸视网膜。J. 添加1-2滴的ProLong ® 金抗荧光淬灭封固每个视网膜和盖玻片的表面上。在成像之前，让其在平坦的表面上干燥过夜。

平装免疫染色
吸PBS从每个孔和替换500 μ 升平坦的载置的封闭缓冲液。在摇杆上于室温下孵育1-2小时。
封闭时，在Flat Mounting封闭缓冲液中以1：250稀释一抗（Guinea Pig-Anti-RBPMS）。
1-2小时后，吸出封闭缓冲液并添加〜200 μ 升稀释的初级抗体的各孔中。在摇杆上于4 °C 孵育24-48小时。
吸出一抗并用1x PBS冲洗视网膜3次，每次15分钟。
在Flat Mounting Blocking Buffer中以1：500稀释二抗（Anti-Guinea Pig-Alexa Fluor 647）。
吸出最后的洗液，并在每个孔中加入〜200 ul稀释的次要溶液。在摇杆上于室温下孵育2-4小时。
注意：或者，视网膜可以在摇杆上于4 °C 孵育24小时。

吸出二抗并用1x PBS冲洗视网膜3次，每次15分钟。
最后一次洗涤后，使用切开的3 ml移液管将视网膜移至干净的玻片上。
将视网膜神经节细胞一侧朝上放置，然后使花瓣去卷曲，使它们尽可能平坦（图4I）。使用Kimwipe除去多余的PBS，注意不要触摸视网膜。
地方1-2滴的的ProLong ® 金抗荧光淬灭封固每个视网膜和盖玻片用22×22毫米的微型盖玻片的表面上（图4J）。
让幻灯片在避光的平面上放置一整夜。
图像上的共焦显微镜的视网膜在10倍获取瓷砖扫描的整个平坦安装通过RGC层视网膜Z-堆叠（图小号5A- 5 B）。
最大强度投影Z堆栈并进行RGC生存的量化。

数据分析

定量RGC生存
在计数之前，为每个导出的TIFF图像设置比例。
人工计数在外围视网膜神经节细胞（〜150-200 μ 米来自视网膜的边缘的距离），中间（〜700-800 μ 米远离边缘）和中央（〜1 ，500-1 ，600 μ 中号远离使用FIJI ImageJ中的“单元格计数器”功能（图5C ）显示每个象限的边缘区域。
使用以下公式计算每个区域（中央，中间，外围）的平均RGC单元密度（D）：D = [（R1 + R2 + R3 + R4）/ 4] / A其中R等于给定图像的RGC数量，并且等于面积（mm 2 ）。
使用以下公式计算整个视网膜RGC密度：（D C + D M + D P ）/ 3 其中D C ，D M 和D P分别代表中央，中间和外围区域的平均密度（图5D）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902757--1314 Michael Kapiloff 799095 \ Figs jpg \ Fig 5.jpg

图5. RGC生存的量化。10 X 瓦扫描/的Z-投影共聚焦图像A. AAV2-mCherry的和B. AAV2-4D3（E）处理过的-mCherry视网膜铺片C. 计数的RBPMS +细胞的数目在中央（C），中（M）以及每个象限的外围（P）区域，并如上所述计算RGC密度。D. 从Boczek 等人改编的mCherry和4D3（E）处理的视网膜的RGC存活率比较，2019年。

清晰的视神经再生的定量
使用500 µm比例尺将共聚焦图像导出并转换为TIFF格式。
使用Photoshop，制作带有红线的度量尺标尺，其均匀间隔250 µms，并另存为PSD格式（图6A）。
打开视神经TIFF和PSD标尺图像。选择标尺并复制/粘贴到视神经图像。使用“编辑”下的“自由变换”更改标尺的长度，以使第一和第三红线之间的距离等于500 µm （图6B）。如果视神经不直，则使用2-3个尺子（图6C）。
手动计算穿过每条红线的CTB阳性点的数量，这些点从挤压部位开始0.5毫米，一直延伸到正畸或最长的再生轴突末端。

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图6.再生轴突的定量。A. 在Photoshop中创建一个标尺，其中两个红色线之间的距离等于250微米。B. 将标尺复制到图像层，然后选择“自由变换”以设置比例，以使第一条和第三条红线之间的距离为500 µm。C. 旋转标尺，并将第一条红线放置在挤压部位上（红色星号）。如果视神经不直，请复制另一把尺子，然后根据视神经的实际形状旋转。白色星号表示第一和第二标尺的连接。

菜谱

平装阻塞缓冲器
1.2毫升（3％）Triton X-100

0.2毫升（0.5％）吐温20

0.4克（1％）BSA

1毫升（0.1％）4％叠氮化钠

填充至40 ml 2 x PBS

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院EY026766（MSK和JLG），EY031167（MSK），斯坦福大学P30-EY026877，EY025915（EGC）的部分支持，以及Research to Prevention Blindness，Inc.的无限制拨款。

EGC，XX，JG和MA参与了手稿的设计，数据采集和编写。JLG和MSK资助并监督了这项工作。所有作者都阅读并编辑了手稿。该协议改编自Boczek 等。（2019 ）和Apara 等。（2017年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有动物实验均已根据斯坦福大学实验动物管理行政小组（协议编号：30550，exp.06 / 19/2020）的指导原则进行批准并进行，并符合《 ARVO动物使用声明》眼科和视觉研究。

参考文献

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