材料和试剂

1.5 ml无RNase的Safe-Lock Eppendorf管
21 G针
用于1.5 ml Eppendorf管的Micro-Tube聚丙烯杵（Bel-Art，目录号：BAF199230001）
量子位分析管（Thermo Fisher，目录号：Q32856）
无RNase的PCR条和盖
新鲜纸巾或液氮速冻纸巾
曲卡因甲磺酸盐（MS-222，Sigma-Aldrich，目录号：E10521）
碳酸氢钠NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
的Dynabeads mRNA的直接纯化试剂盒（赛默飞世Invitrogen，目录号：61011）
不含Turbo DNase的试剂盒（Thermo Fisher Invitrogen，目录号：AM1907）
Bioanalyzer RNA 6000 Nano试剂盒（安捷伦，目录号：5067-11511）
生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4626）
Qubit RNA BR试剂（Thermo Fisher，目录号：Q10211）
PrimeScript RT 预混液（宝酒，货号：RR036A）
用于CFX的Sybr Select 预混液（Thermo Fisher Applied Biosciences，目录号：4472942）
TruSeq链式mRNA试剂盒（Illumina，目录号：20020594）
SuperScript II逆转录酶（Thermo Fisher，目录号：18064014）

设备

剪刀（或刀片）和镊子
DynaMag2磁体（赛默飞世在vitrogen，目录号：12321D）
PCR循环仪（例如，Bio - Rad C1000 Touch，目录号：1851196 ）
量子比特荧光计（Thermo Fisher，目录号：Q33238）
CFX96 Touch实时PCR循环仪（Bio - Rad，目录号：1855195）
2100生物分析仪（安捷伦，目录号：G2939BA）

软件

FastQC（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）
Cutadapt（https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/#）
STAR （Dobin 等，2013）
袖扣（Trapnell et al。，2012）

程序

笔记：

对于从棘背g组织（?50 mg）冷冻的mRNA提取，请使用：
250 μ 升的裂解缓冲液

100 μ 升的的Dynabeads

600 μ 升的洗涤-A溶液（两次洗涤）

300 μ 升的洗涤-B溶液

è 琵琶?20 μ 升无RNA酶的水

可以针对不同大小的组织样本按比例缩放体积。

程序BG改编自最初的Invitrogen Dynabeads 方案，并修改了溶液体积，样品均质化和裂解步骤。需要额外的步骤HJ（不是Invitrogen原始协议的一部分）来确保无DNA的高质量mRNA的产量。
应立即遵循BH 程序。可以暂停实验的安全停止点是在过程A和H 之后。

解剖整个棘背g
根据动物规程准则（例如，欧盟指令2010-63-eu和AVMA准则）对鱼实施安乐死，例如，用NaHCO 3 缓冲的三卡因甲磺酸盐（MS-222，pH 7.5）麻醉过量。注意，适当的浓度取决于鱼的大小。对于棘背类动物，我们使用10倍溶液（1.5 g / L），该溶液是通过将1.5 g MS-222和3.0 g NaHCO 3 溶解在1 L水族馆水中制得的。
用手术刀和镊子取下头部（图1）。从腹侧开始，打开腹盖以露出g弓。如图1 B 所示，切出没有腹侧和背侧附着点的腮弓。雷姆OVE任何结缔组织不是鳃的一部分。
将1.5组织（?50 mg）收集在1.5 ml Eppendorf Safe-Lock管中，并立即在液氮中速冻。
将样品储存在-80 °C。
安全停止点

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902789--1295 Jukka-Pekka Verta 793031 \ Figs jpg \ Fig 1.jpg

图1. 刺le的解剖。通过沿横断面（红线，A ）解剖取下头部，从安乐死的鱼中分离出整个isolated弓。然后在腹侧视图（B ）中，通过解剖腹侧和背侧附着点（红线，B ）切除g弓（蓝线）。

洗涤并重悬Dynabeads
使Dynabeads 和溶液温热至室温。
每个组织样本准备一份1.5 ml Eppendorf。重悬的Dynabeads 轻轻吹打向上和向下，并等份100 μ 升的磁珠到每个1.5毫升Eppendorf管。
将试管放在DynaMag2磁铁上，等待约30 s，使磁珠形成沉淀（约30 s）。
除去上清液，不要干扰珠子。
从磁铁上移开试管，然后将Dynabeads重悬于原始体积的裂解缓冲液（100μl ）中。

使用杵将组织均质化为粉末
笔记：

通过用无菌剪刀或刀片将杵的圆锥形表面切成有角的表面，来修改Micro-Tube均质杵，以更好地破坏样品（图2）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902789--1295 Jukka-Pekka Verta 793031 \ Figs jpg \ Fig 2.jpg

图2. homogeniz的变形荷兰国际集团杵。为了更有效地破坏样品，请用无菌剪刀或手术刀刀片将杵的表面（红线，A ）切成有角度的表面（B ）。

将样品浸入液氮中以冷却杵，然后破坏样品。
从-80°C取出样品，并保持液态氮。
使用1.5 ml Eppendorf管中的研棒在液氮上将组织打成粉末。
在进行以下裂解步骤之前，请避免所有阶段的样品熔化。冷冻会破坏细胞膜并使RNA暴露于内源性RNase中，后者在解冻后会降解RNA。始终将冷冻样品放在液氮中。一旦引入了RNase抑制剂（例如Dynabeads 裂解缓冲液中的LiCl ，方案中的下一步），就可以有效地抑制RNA降解并解冻样品。

裂解细胞
采取样品管直径：NE通过一个出液体氮，取出杵，但在250保持在手里，立即吸管μ 升裂解缓冲液中，然后丢弃该杵回管。
将冷冻管保存在您的手中，并用杵研磨冷冻的裂解缓冲液直至其融化，以确保融化后立即将样品悬浮在裂解缓冲液中。
对每个样本重复。
在进行操作之前，将裂解液通过21号针头移入5次，以弃去杵和剪切DNA。
注意：在您的试管仍然冻结时，引入裂解缓冲液。

将mRNA绑定到Dynabeads
添加100 μ 升洗涤和再悬浮的Dynabead 每个样品，在室温下孵育5分钟，用CONTIN uing旋转（?500 RPM）。

注意：在此孵育步骤中连续混合对于减少Dynabeads 与基因组DNA 的结合非常重要。

洗涤Dynabead -mRNA复合物
将样品放在Dynamag 磁铁上，等待磁珠形成沉淀（约30 s）。
从试管中除去所有上清液，而不接触珠粒。
从磁铁上移开试管，然后将珠重悬于600μl 洗涤缓冲液A中。
重复步骤s F 1- F 3进行第二次缓冲液A洗涤。
去除缓冲液，并使用300执行最后洗涤微升洗涤缓冲液B.
笔记：

使用前，清洗缓冲液应在室温下。
始终通过缓慢上下吹打溶液将珠子完全重悬在洗涤缓冲液中。重悬不足会导致DNA和核糖体RNA污染增加。重悬后应该没有可见的珠子团块。通过使用尽可能减少吸取珠子所需的最小量移液来避免RNA过度剪切/片段化。
您可以执行3 次洗涤A 以获得更好的样品纯度。

从珠子洗脱mRNA
将样品放在磁铁上，等待珠子形成沉淀（约30 s）。
从试管中取出所有上清液，注意不要留下任何残留的缓冲液。
从磁体和r除去管esuspend珠20 微升无RNase水。
在热循环仪或热混合器中于65°C孵育样品2分钟。
立即将样品放在磁体上，然后将上清液移至新的无RNase的1.5 ml Eppendorf管中。

用DNase处理mRNA提取
到20 微升洗脱的mRNA，加入2 微升的Turbo DNA酶缓冲液+ 1 微升的Turbo DNA酶。
在37°C下孵育20分钟。
加入5μl 灭活溶液，轻弹试管，在室温下孵育5分钟。
以10,000 xg 旋转1分钟30 s，并将上清液转移至新鲜的无RNase的试管中。
卡扣冻结最终mRNA提取较小等分试样（例如，10 微升）在液氮中，并存储在-80℃。
安全停止点

笔记：

治疗牛逼他整个20 微升mRNA的等份具有DNA从珠洗脱之后，不冻融。
无论是量化和质量控制（例如，量子比特和生物分析仪）的基因后立即DNA酶treatme NT或单独保留这些等分。始终避免mRNA样品的冻融循环。
mRNA样品中20-30％的核糖体RNA污染很常见。通过优化A洗涤体积，可以减少rRNA污染。您也可以尝试将裂解缓冲液加热至65°C或在珠子位于裂解缓冲液中时于65°C进行洗脱-重新结合循环。
Illumina TruSeq RNA- seq 方案始于mRNA选择，从而消除了大多数核糖体RNA和DNA污染（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902789--1295 Jukka-Pekka Verta 793031 \ Figs jpg \ Fig 3.jpg

图3.使用管家基因的qPCR检测提取的mRNA中的基因组DNA污染。阳性对照（cDNA）的和mRNA的提取用的持家基因的引物的qPCR（扩增例如，紧密连接蛋白）。较低的Ct值（PCR周期，当可以检测到高于背景水平的荧光时，绿线）表示模板的丰度较高，在非逆转录mRNA提取的情况下，则表示来自基因组DNA的污染。未经DNase处理的Dynabeads mRNA提取物显示出DNA污染，在Illumina TruSeq RNA- seq 方案开始时执行第二个mRNA选择步骤后，几乎完全消除了DNA污染。经DNase处理的mRNA提取物未显示扩增，因此不含DNA。

验证不存在基因组DNA污染
设计的一对扩增持家基因的PCR引物（例如，紧密连接蛋白），确保引物扩增一个单一的外显子内的片段（PCR片段不应跨越外显子-内含子边界）。目的是针对管家基因特有的引物（例如使用BLAST搜索，验证其他基因的序列相似性），以G / C核苷酸结尾并具有60 °C 的解链温度 ± 5 °C。对于棘背g 组织，我们使用claudin基因作为对照（Fwd：5'ACTTGGTGCCCTATCAAATGAGGTA 3'，Rev：5'AGTTATACACGACGGGAGGATTGAG 3'）。
选择阳性对照样品，并使用Takara PrimeScript RT Master Mix将mRNA反转录为cDNA 。
到5 微升mRNA提取，加入3 微升的水和2 微升的PrimerScript 主混合物。
在37 °C下孵育15分钟。
储存在-20 °C。
准备用于阳性对照（cDNA）的qPCR反应，并选择用于验证的mRNA提取物。
10 微升的2X 的Sybr 选择CFX主混合物

1 微升10 毫正向引物

1 微升10 毫反向引物

2 微升水

1 微升cDNA模板

使用以下程序在qPCR上运行样品：
50°C 2分钟
95°C 2分钟
95°C 30秒钟
55-65°C（特定于底漆的熔化温度）30 s
72 °C 30秒
[R E打开吨ò ? 。再增加39个周期
高温于4 °C
分析qPCR结果（图3）。经DNase处理的mRNA提取物不应扩增，而逆转录cDNA制备物应发出信号。没有逆转录的mRNA提取扩增表明来自基因组DNA的污染。在这种情况下，用DNase处理样品，并使用Bioanalyser 验证mRNA的质量。

使用Bioanalyzer RNA 6000 Nano试剂验证提取的mRNA的质量（图4）。对于小于?5 ng / μl的浓度，请使用Bioanalyzer RNA 6000 Pico试剂。
注意：通常用于总RNA提取的RNA完整性数（RIN）不适用于mRNA提取，因为已删除了用于计算RNA质量和检测降解的大部分核糖体RNA。取而代之的是，使用mRNA片段大小的分布来确定样品质量好（一定范围的大小是高分子量）还是质量差（低分子量的RNA高度降解）（图4）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902789--1295 Jukka-Pekka Verta 793031 \ Figs jpg \ Fig 4.jpg

图4 。用生物分析仪检验mRNA的质量。使用Bioanalyser RNA 6000 Nano试剂分析的高质量（A）和劣质（B）mRNA样品示例。高质量的mRNA提取可显示出rRNA污染程度（10-30％）。25 nt 处的第一个峰对应于标记，（A）中的两个显着峰对应于18S和28S rRNA，宽峰对应于mRNA。请注意，劣质样品中mRNA大小分布的左移（较小大小的片段），表明mRNA片段已降解。

使用Illumina TruSeq 试剂盒和试剂盒说明构建RNA-seq文库，但以下情况除外：
使用150 ng mRNA作为输入（使用BioAnalyzer RNA Nano或Qubit RNA BR试剂进行定量）。用不含RNase的水稀释至最终体积为50μl 。使用足够量的输入mRNA有助于避免最终测序文库中过多的PCR复制。
针对您要使用的测序策略优化片段化时间。使用时间序列测试片段化时间的影响，并使用Bionalyzer High Sensitivity DNA试剂分析片段大小，或参阅Illumina TruSeq RNA样品制备v2指南第109页。对于使用HiSeq 3000 150碱基对配对末端读数的棘背ill mRNA测序，我们使用了2 分钟（或2分钟）的片段化，最终平均插入片段大小约为290 bp。
使用提供的索引来识别测序后的样品，并以等摩尔量进行测序。为避免可能的批量影响，建议的策略是使用与样本数量一样多的索引，并在同一泳道中对所有样本进行排序。在实验设计允许的情况下，使用复制泳道并结合来自复制泳道的读数以达到所需的测序深度。

数据分析

下面的一般示例是在Unix / Linux / MacOSX 环境中使用命令行工具分析的三脊背棘鱼g 组织的150个碱基对的末端RNA-seq读数。鼓励用户修改以下过程中概述的路径以匹配其数据，并使用Shell脚本或复制粘贴在终端窗口中执行代码。有关测试样品组的详细信息，请参见Verta 和Jones （2019 ）。

按照FastQC 网站和手册中概述的准则，使用FastQC 软件验证读取和库的质量。（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）
注意：FastQC 可能报告RNA- seq 库包含高水平的PCR重复。这并不一定意味着文库已经进行了过多的PCR，因为预计许多读物会映射到高度丰富的转录本，FastQC 可以将其解释为PCR重复。

使用TrimGalore 从读数中修剪所有Illumina测序适配器。（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）
注意：或者，可以使用fastp 软件在一个步骤中执行质量控制和适配器修整（Chen et al。，2018）。

trim_galore \

- path_to_cutadapt cutadapt \

- 照亮\

-严紧度5 \

-质量20

- OUTPUT_DIR out_dir \

-配对

reads_R1_001.fastq.gz \

reads_R2_001.fastq.gz

生成STAR 基因组文件（仅在第一次使用给定的参考基因组时才需要）。

STAR \

- runMode genomeGenerate \

- runThreadN ?\

- genomeDir 基因组\

- 基因组FastaFiles gasAcu1.fa \

- sjdbGTFfile transcript.gtf \

- sjdbOverhang 149 \

- 基因组ChrBinNbits 18

对齐RNA测序读取到参考基因组（例如，宽S1，gasAcu1 [ 琼斯等人，2012 ] ）与STAR aligner- 高执行对准该地址许多的带调心拼接有关的挑战RNA测序跨越内含子/外显子奔读取参考基因组的daries （Dobin 等人，2013年）。使用手动两次通过模式最灵敏地检测新型内含子-外显子边界。
对于每个样品，执行STAR 1 st pass以鉴定当前样品中的内含子/外显子边界。

STAR \

- readFilesCommand gunzip解-c \

- runThreadN ?\

- outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonicalUnannotated \

- chimSegmentMin 50 \

- outFilterType BySJout \

- alignSJDBoverhangMin 1 \

- alignIntronMin 20 \

- alignIntronMax 200000 \

- alignMatesGapMax 200000 \

- quantMode GeneCounts \

- outWigType 摆动\

- outSAMtype BAM SortedByCoordinate \

- twopassMode 无\

- genomeDir 基因组\

- readFilesIn reads_val_1.fq.gz reads_val_2.fq.gz

对于每个样品，运行STAR 2 次使用跨越样本识别的内含子/外显子边界以上通知读对准通过。

STAR \

- readFilesCommand gunzip解-c \

- runThreadN ?\

- outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonicalUnannotated \

- chimSegmentMin 50 \

- outFilterType BySJout \

- alignSJDBoverhangMin 1 \

- alignIntronMin 20 \

- alignIntronMax 200000 \

- alignMatesGapMax 200000 \

- quantMode GeneCounts \

- outWigType 摆动\

- outSAMtype BAM SortedByCoordinate \

- twopassMode 无\

- genomeDir 基因组\

- limitSjdbInsertNsj 2000000 \

- readFilesIn reads_val_1.fq.gz reads_val_2.fq.gz \

- sjdbFileChrStartEnd SJ_1.out.tab \

- sjdbFileChrStartEnd SJ_2.out.tab \

…

使用Cufflinks2.2 管道（Trapnell 等人，2012）进行参考指导的转录组装配以及转录本和同工型表达水平测试。为了以“参考指导”模式运行，需要描述已知基因模型的转录本gtf 文件。如果此信息不可用，袖扣还允许“无指导的”从头转录组装配。

袖扣

-p N \

--min-intron-length 20

--library型FR-firststrand \

- ?./ cloutGuided \

--frag-bias-correct gasAcu1.fa \

--multi-read-correct \

--min-isoform-fraction 0.15 \

--min-frags-per-transfrag 20 \

--max-multiread-fraction 0.5

-g transcript.gtf \

reads.out.bam

将样本级别的注释文件合并在一起（在assembly_list.txt中指定）。

cuffmerge \

-g transcript.gtf \

-o merged_assembly \

-s gasAcu1.fa \

-p N \

assembly_list.txt

量化基因模型上的RNA-seq读取覆盖率。

cuffquant \

-o out_dir \

-p N \

-v \

-u \

--library型FR-firststrand \

-b gasAcu1.fa \

merged.gtf \

reads.out.bam

标准化样本之间的读取覆盖率。

cuffnorm \

-p N \

-o out_dir \

-library型FR-firststrand \

-标签样本

merged.gtf \

abundances1a.cxb \

abundances1b.cxb \

abundances2a.cxb \

abundances2b.cxb \

…

使用Cufflinks 函数cuffdiff 测试样本组之间的差异表达。

cuffdiff \

-p N \

-o outDir \

-b gasAcu1.fa \

-u \

-每个条件的分散方法

-library型FR-firststrand \

--labels Group1 ，Group2 \

merged.gtf \

abundances1a.cxb ，abundances1b.cxb \

abundances2a.cxb ，abundances2b.cxb \

…

致谢

FJ由欧洲研究委员会（FP7）和马克斯·普朗克学会资助。该协议改编自Verta 和Jones （2019 ）。

伦理

所有动物实验均按照欧盟和国家法规进行，并避免了对动物的不必要伤害（欧盟指令2010_63_EU）。

参考文献

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Dobin ，A.，戴维斯，CA，Schlesinger，F.，Drenkow ，J.，Zaleski，C.，Jha，S.，Batut ，P.，Chaisson ，M.和Gingeras ，TR（2013）。STAR：超快速通用RNA-seq对准仪。生物信息学29（1）：15-21。
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琼斯，FC，Grabherr ，MG，陈，YF，罗素，P.，Mauceli ，E.，约翰逊，J.，斯沃福德，R.，Pirun ，M.，Zody ，MC，白色，S.，伯尼，E. ，Searle，S.，Schmutz，J.，Grimwood ，J.，Dickson，MC，Myers，RM，Miller，CT，萨默斯，BR，Knecht，AK，布雷迪，SD，Zhang，H。，花粉，AA，Howes ，T.，Amemiya ，C.，Broad Institute Genome Sequencing，P.，Whole Genome Assembly，T.，Baldwin，J.，Bloom，T.，Jaffe，DB，Nicol，R.，Wilkinson，J.，Lander， ES，Di Palma，F.，Lindblad-Toh ，K. and Kingsley，DM（2012）。三脊背棘回适应性进化的基因组基础。自然484（7392）：55-61。
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Verta ，JP和Jones，FC（2019）。棘回的平行表达差异中顺式调节的优势。Elife 8 ：43785。
Verta，JP，Landry，CR和Mackay，J.（2016）。使用单倍体/二倍体植物系统解剖表达定量性状基因座和等位基因特异性-深入了解种群内转录调控的补偿性进化。新植物学家211（1）：159-171。