材料和试剂

剃须刀
10厘米细胞和组织培养皿（Biofil ，目录号：TCD-010100）
15 ml离心管（Biofil ，目录号：CFT-011150）
鹘? 50ml离心管中（Corning，目录号：352070）
1000点微升的提示（美国科学，目录号：11112021）
200点微升的提示（爱思进，目录号：T200-Y）
0.5-10 微升提示（爱思进，目录号：T300）
1.5 ml 微管（Axygen ，目录号：20220415）
爱思进? 1.5毫升Maxymum 恢复? 离心管（低保留）（Corning公司，爱思进? ，目录号：MCT-150-LC）
聚丙烯共聚物超速离心管（容量为2.2 ml，日立工机S300536A）
聚碳酸酯管，容量为0.5 ml （Beckman Coulter，目录号：343776）
200个微升凝胶放入提示（赛默飞世尔科技，产品目录号：010-Q）
帕拉贡? 一次性使用无菌刀片（穿衣，目录号：90010-10）
Bemis TM Parafilm TM M实验室包装膜（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-374-12）
的Immobilon ? -P转移膜PVDF 0.45 微米（默克，目录号：IPVH00010）
康宁1升过滤器系统0.22 微米（康宁，目录号：431098）
Sprague-Dawley大鼠
Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12800082）
Opti-MEM（Gibco，目录号：31985070）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10270106）
青霉素链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
聚乙烯亚胺（Polysciences ，目录号：23966-1）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩液（Bio-Rad实验室，目录号：5000006）
液氮
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200056）
OptiPrep TM 密度梯度介质（Sigma-Aldrich，目录号：D1556）
艳蓝色R（Sigma-Aldrich，目录号：B0149）
2-巯基乙醇（βME）（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
3色常规蛋白质标记物（Genefist ，目录号：GF6616）
印迹等级阻滞剂（Bio-Rad实验室，目录号：1706404）
钠叠氮化物（NAN 3 ）（Sigma-Aldrich公司，目录号：S8032）
SuperSignal TM 西微微PLUS化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：34580）
HEPES（Acros Organics，目录号：172571000）
氯化钾（KCl的）（VWR化学BDH ? ，目录号：2576）
36. 乙酸钾盐（KOAc ）（Fisher Scientific，目录号：127082）
四水合醋酸镁（Mg （OAc ）2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M0631）
D-山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：151213）
溴酚蓝
Tris（Affymetrix，目录号：75825）
甘氨酸
40％丙烯酰胺/双解溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610148）
过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
45. N ，N，N '，N'- 四甲基乙二胺（Sigma-Aldrich，目录号：T7024）
46。磷酸二氢钠二水合物（的NaH 2 PO 4 ·2H 2 O）（VWR化学BDH ? ，目录号：1514L）
47。磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
48. 氯化钠（NaCl）（西格玛奥德里奇，目录号：S5886）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7757）
的Triton ? X100（Sigma-Aldrich公司，目录号：X100）
吐温? 20（Sigma-Aldrich公司，目录号：P1379）
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂（罗氏，目录号：05056489001）
DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
洋地黄皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：D141）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
磷酸肌酸（罗氏（Roche），目录号：10621722001）
肌酸激酶（罗氏（Roche），目录号：10736988001）
腺苷5 ' 三磷酸（ATP）（Sigma-Aldrich公司，目录号：2383）
鸟苷5'-三磷酸二钠盐（GTP）（FUJIFILM Wako Pure，目录号：073-03113）
甲醇（Scharlab ，目录号：0949）
来自glycine max（大豆）的胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：T9003）
HyClone公司? 台盼蓝溶液（GE Healthcare公司，HyClone公司TM ，目录号：SV30084）
抗体
Rabbit anti SEC22B是Randy Schekman 教授（美国加利福尼亚大学伯克利分校，美国）提供的礼物，使用量为1：2,000
绵羊抗TGN46（Bio-Rad实验室，目录号：AHP500G），以1：2,000的浓??度使用
兔抗HA（细胞信号技术，目录号：3724），以1：2,000的比例使用
辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔IgG抗体（GE Healthcare，目录号：NA934），以1：5,000的浓??度使用
抗绵羊IgG-过氧化物酶抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A3415），以1：5,000的浓??度使用
缓冲溶液（请参阅配方）
KHM缓冲区（1×）
KHM缓冲器（2×）
KHM缓冲器（10×）
SDS-PAGE蛋白加载缓冲液（5×）
传输缓冲区
SDS-PAGE运行缓冲区
5％印迹级别的阻滞剂
PBS
PBST
缓冲液E
裂解缓冲液
储备溶液（请参阅食谱）
10×PBS，pH 7.4
SDS-PAGE运行缓冲区（10 ×）
1 M KOAc
1 M HEPES-KOH，pH 7.2
1 M镁（OAc ）2
1.5 M Tris-HCl，pH 8.8
1 M Tris-HCl，pH 6.8
10％SDS
10％APS
3％NaN 3
40 mg / ml洋地黄皂苷
100x蛋白酶抑制剂
500毫米DTT
ATP再生系统（ATP rs 。）
10 mM GTP
1毫克/毫升聚乙烯亚胺

设备

小烧杯
解剖剪刀
-80°C冷冻室
钻（工匠3/8英寸专业电钻）（工匠，型号315.269460 或等效）
杜恩斯匀浆器（金宝? 886000-0024 Kontes ? 45毫升Potter- Elvehjem 组织研磨聚四氟乙烯杵和非磨玻管，大小：24，制造商零件编号：KIM-886000-0024）
的Eppendorf ? 5418R离心机，冷藏，与转子FA-45-18-11和转子盖仪（Eppendorf ? ，型号：5418R，目录号：5401000013）
Beckman Coulter公司高速离心机，具有转子JA-25.50转子盖（Beckman Coulter公司，型号：阿凡提? JE，目录号：369001）
带T-865转子和转子盖的日立超速离心机（日立，目录号：S99978101）
具有10倍或20倍物镜的光学显微镜（任何简单或复合的光学显微镜都可以）
Hitachi Koki himac CS150NX微型超速离心机，带有S55S-2080转子，S120A3-2061转子和转子盖（日立，目录号：HK-CS150NX）
Barnstead Thermolyne （Thermo Fisher，型号：DB16520-26 目录编号：05852 ）
精英干浴培养箱（主要科学，型号：EL-02目录编号：95070）
的Eppendorf ? 5804R离心机转子与A-4-44仪（Eppendorf ? ，型号：5804R，目录号：5805000327）
细胞破碎（否决精灵? ，目录号：SI-D268）
ChemiDoc TM MP成像系统（Bio-Rad实验室，型号：ChemiDoc TM MP）

软件

ImageLab 软件v4.0
图像

程序

注意：除非另有说明，所有步骤均在冰上进行，所有离心均在4°C下进行。

从大鼠肝脏制备细胞溶质
从几只大的Sprague-Dawley大鼠中解剖出肝脏。每个肝脏通常重约15克。通常，每个肝脏的最终产量约为15 ml胞质级分，蛋白质浓度为30 mg / ml。
注意：使用大型Sprague-Dawley大鼠的申请必须由动物使用和护理委员会（UCUCA）提交并批准。

解剖后，将每个肝脏放入冷却的50 ml康宁管中，用冷PBS冲洗3次（每次清洗约25 ml）。
称取肝脏，然后切割成一个糊状机智?刀片和清扫剪刀上的冰冷P ETRI菜。每1克肝脏添加2毫升冷缓冲液E（配方A 1 ）。
在冷室中用钻床分批（每批约1块肝脏）进行大均质化。中型杵用5笔，紧实杵用5笔。请注意，戴上护目镜。均质化后，大鼠肝脏将被均质化为小块，并且不会清楚地检测到大鼠肝脏的大碎片。
离心机在50ml管中的整个匀浆以1000 ×g离心10分钟，在4℃在Eppendorf ? 5418R冷藏centrifu GE使用FA-45-18-11转子。收集上清液并弃去沉淀。
离心上清液在18459 ×g离心20分钟，在4 ℃下在Beckman Coulter公司高速离心机（Beckman Coulter公司，阿凡提? 使用JA-25.50 RO JE）TOR。收集上清液并弃去沉淀。
离心上清液在125171 ×g下1个小时，在4 ℃下我N使用T-865转子日立超速离心机（日立超速离心机）。
取深红色部分（避免沉淀和漂浮的脂肪层），并重复高速旋转2或3次。
由第测定蛋白浓度?Bradford测定和等分试样在100 μ 升和1ml的量。
注意：18-30 mg / ml的浓度范围被认为是成功提取。

将速冻等分试样迅速注入液氮中，并储存在-80 °C下。避免重复冻融循环。
注意：制备大鼠肝细胞溶质的离心步骤如图1所示。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902842--1296郭玉松636915 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.离心制备大鼠肝细胞溶质

从培养的HEK 293T细胞制备供体膜（DM）（在反应当天制备，图2）

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902842--1296郭玉松636915 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.从TGN重构水泡释放的测定的示意图。半完整的细胞作为供体膜（DM）的出芽反应和囊泡形成测定和从半完整细胞产生的小泡的隔离的程序的制剂在过程被描述小号B和C分别。货物进入囊泡的包装效率，通过如在步骤d中描述（免疫测定吨他的图是从马订正等人，2018）。在DM 都还需要进行免疫印迹。

在37 °C 的细胞培养CO 2 培养箱中，在GIBCO Dulbecco改良的Eagle培养基中培养两个10 cm的HEK 293T细胞板，该培养基包含10％胎牛血清（FBS），10 milliunits / ml青霉素和0.1 mg / ml链霉素。提供5％的CO 2 和约95％的相对湿度。在实验当天，细胞将生长至80-100％融合。
注意：如有必要，转染质粒可在实验日前24小时编码货物蛋白。

从两个10 cm HEK 293T细胞板中吸出培养基。
每个板用5 ml PBS洗涤细胞2次。
在每个平板中加入10 ml含10％FBS的Opti-MEM，用石蜡膜密封平板，并在20°C水浴中流动2小时。
每个板用5 ml PBS 洗涤细胞2次。
向每个平板中加入1 ml 0. 25％胰蛋白酶，并在室温下孵育2分钟。
用6 ml PBS缓冲液从每块板中收集细胞到15 ml F alcon管中。
向每个试管中加入25μl10 mg / ml胰蛋白酶抑制剂，并充分混合。
在4°C下以300 xg离心3分钟。吸出上清液，将细胞重悬于每个试管中的4 ml 1×KHM缓冲液（配方A 1 ）中。
向细胞中加入4μl 洋地黄皂苷（在DMSO中储备40 mg / ml），使最终浓度为40μg / ml。充分混合并在冰上孵育5分钟。
在每个试管中的细胞中加入8 ml 1 ×KHM缓冲液，颠倒试管，立即在4°C下以300 xg 沉淀细胞3分钟。
吸出上清液，将细胞沉淀重悬于每个试管中的1 ml 1×KHM缓冲液中，并转移至1.5 ml微量离心管中。
注意：要检查通透性是否正常，请添加3 μ升细胞的3 μ 升台盼蓝，小心地放置在样品上盖玻片，然后检查透化的细胞的百分比在光学显微镜下以16×物镜。在此阶段应透化100 ％的细胞。核为蓝色，完整的ER为棕色。如果渗透效果不佳，建议使用新鲜制备的洋地黄皂苷溶液进行实验。

在冰上孵育细胞5分钟，在10,000 xg 于4°C下沉淀细胞5 s，然后吸出上清液。重悬130沉淀微升1×KHM在每个管缓冲液和半完整细胞的悬浮液合并成一个1.5 ml离心管。

重建TGN释放的囊泡
在低保持管，组装囊泡通过在表1中的每个100加入配料出芽反应μ 升反应含有ATP再生系统（1毫摩尔ATP，40mM的磷酸肌酸，0.2毫克/毫升的肌酸phosphoki 在KHM缓冲器核苷酸酶），0.2 mM的GTP ，1个μ 克Sar1A H79G蛋白（GTP酶有缺陷的Sar1A突变形式）和大鼠肝胞质溶胶（4毫克/毫升）。
注意：Sar1A H79G蛋白是从大肠杆菌纯化的C端His标记蛋白。首先添加KHM缓冲液，核苷酸和Sar1A H79G蛋白。用移液器充分混合，并短暂离心以收集每个管底部的液体。然后加入半完整细胞，并轻轻上下吹打直至均匀，进行混合。最后加入大鼠肝细胞溶质，并轻轻移液混合。

表1. TGN囊泡形成试验中添加的成分

没有核苷酸

没有Sar1A（H79G）

一切

加GMPPNP

KHM缓冲器

395

340

335

335

ATP 再生系统

0

50

50

50

GTP

0

10

10

0

GMPPNP

0

0

0

10

Sar1A（H79G）（1 μ 克/ ml）的

5

0

5

5

半无效细胞

50

50

50

50

胞浆（终浓度2 mg / ml）

50

50

50

50

总

500

500

500

500

注意：每列代表一个实验组。每行代表反应，并加入到reactio体积的部件在正μ 升。反应的总体积为500 μ 升。而不核苷酸实验组是使用吨O监控胞质水平被离心后扩散到囊泡分数蛋白，并监测货物蛋白质是在囊泡分数独立GTP和ATP的水平。在GMPNP（一种不可水解的GTP类似物）的存在下进行的实验小组是要监测与GTP水解无关的囊泡级分中存在的胞质蛋白和货物蛋白的水平。Sar1A（H79G）在GTP水解中有缺陷，并抑制货物蛋白包装到COPII囊泡中。将该蛋白质添加到出芽反应中，以抑制ER介导COPII介导的囊泡形成。

将反应液在32°C下孵育1小时。
孵育后将反应转移至冰中以终止反应。
离心机以14,000 ×g离心20分钟在Eppendorf在4℃下? 5418R使用FA-45-18-11转子以除去细胞碎片的冷冻离心机d LA RGE膜。
将上清液与冷的60％（w / v）OptiPrep TM 和10x KHM缓冲液（配方A 3 ）混合，以在1x KHM缓冲液中达到35％（w / v）OptiPrep TM的最终浓度。
注意：OptiPrep TM 梯度是碘克沙醇在水中的60％（w / v）溶液（无菌）。

将混合样品转移到聚丙烯共聚物超速离心管（容量为2.2 ml，Hitachi Koki S300536A）的底部作为底层。
通过使用凝胶加载尖端在墙上缓慢吸移，在1 × KHM缓冲液中覆盖30％（w / v）OptiPrep TM [ 通过将等体积的60％OptiPrep TM 和2 × KHM缓冲液（配方A 2混合）制备] 作为中层进入超速离心管，直到该管几乎充满了整个样品（底部层+中等层）。
注意：在此阶段，应观察到30％OptiPrep TM 和上清液OptiPrep TM 混合物之间存在相变。

覆盖带50 μ 升1 × KHM吹打慢慢使用凝胶加载缓冲液尖端在顶部层。
注意：一个相间应1之间可以观察到× KHM和30％OptiPrep TM 在1 × KHM。

离心含有SA的超速离心管mple以100,000 ×g下在4℃下用于在加速设置（90分钟加速）3和减速在日立工机4 HIMAC 使用S55S-2080转子CS150NX微超速离心机（日立）。离心后，释放的囊泡将集中在1 × KHM中1x KHM和30％OptiPrep TM 之间的界面上。
收集囊泡通过取200 μ 升离心后的上清液从顶部。将上清液转移至厚壁聚碳酸酯管（Beckman Coulter，容量为0.5 ml，343776）中。添加300 μ 升1X KHM轻轻吹打缓冲到稀样品。
使用S120AT3-2061转子在Hitachi Koki himac CS150NX微型超速离心机（Hitachi）中以100,000 xg 在4°C下离心30分钟，以旋转囊泡。

免疫印迹
通过以下步骤执行标准的免疫印迹程序：

添加20 μ 升1 × SDS-PAGE蛋白质加样缓冲液在管的底部，涡流8分钟以溶解囊泡样缓冲液使用细胞破碎（否决精灵? ）。
添加DM至20 微升裂解缓冲液（配方甲11 ）和在冰上孵育30分钟。
在4°C下以14,000 xg离心5分钟，收集上清液。
在上清液中加入5×SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液（配方A 4 ），使终浓度达到1×SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液。
在55°C下孵育DM样品和高旋转沉淀（HSP）样品30分钟。
根据货物蛋白的大小，将DM样品和HSP样品上样到15个楔形孔中10-15％的凝胶上。
在恒定的20 mA下运行SDS-PAGE，直到染料在室温下用完凝胶（约70分钟）为止。
在4°C下以0.3 A恒定的速度将蛋白质转移到PVDF膜上1-2 小时。
在室温下，在PBST中用5％印迹级阻滞剂（配方A 7 ）封闭PVDF膜30分钟。
在室温下将PVDF膜与一抗孵育1.5-2 h或在4°C过夜。
用PBST洗涤3×5分钟。
在室温下，将与HRP偶联的二抗孵育1小时。
用PBST洗涤3×5分钟。
与HRP底物ECL plus一起孵育，并在带有ImageLab 软件v4.0 的ChemiDoc TM 成像系统上成像。

数据分析

将ImageLab 软件v4.0中的免疫印迹图像导出为。tif 文件。
使用Photoshop和Adobe Illustrator ? 处理图像（图3 ）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902842--1296郭玉松636915 \ Figs jpg \图3.jpg

图3. 从TGN将Frizzled6包装成囊泡的重构。用HA-Frizzled6转染COS7细胞。转染后第1天，使用表1中所示的指示剂进行TGN囊泡释放反应。浮选后的顶部馏分通过用指示的抗体进行免疫印迹分析。TGN46和Sec22分别用作监测TGN 出口和ER出口的阳性对照（Ma 等人，2018年重新发布）。

菜谱

缓冲液
1×KHM（1公升）
将5ml的1M的Mg（OAC ）2 ，20毫升的1M HEPES-KOH，pH 7.2的和110的1M 的KOAc 到0.5升的DDH 2 ?
调节至1 L
过滤缓冲区
储存在4°C
2×KHM（1公升）
加入10 mL的1M的Mg（OAC ）2 ，将40ml 1M的HEPES-KOH，pH 7.2的和220的1M 的KOAc 到0.5升的DDH 2 ?
调节至1 L
过滤缓冲区
储存在4°C
10×KHM（1公升）
将50 ml 1 M Mg（OAc ）2 和200 ml 1 M HEPES-KOH（pH 7.2）添加到0.5 L ddH 2 O
溶解108克KOAc
调节至1 L
过滤缓冲区
储存在4°C
5×SDS-PAGE蛋白加载缓冲液（50 ml）
在不断搅拌下，在装有12.5 ml 1 M Tris pH6.8的小烧杯中溶解3.75 g SDS，93.75 mg溴酚蓝
混合25毫升甘油
用ddH 2 O将体积调节至37.5 ml
等分试样至750 μ 升/管，并储存在-20℃下
加入250 μ 升之前使用βME到等分新鲜注：? 他在5×SDS-PAGE蛋白质加样缓冲液各试剂的最终浓度：7.5％SDS，50％甘油，250 毫摩尔Tris-HC 升和0.19％溴酚蓝， 25％βME（v / v）。
转移缓冲液（2 L）
溶解6.03克Tris和28.8克甘氨酸在1.5L的DDH 2 ? （?F 伊纳勒浓度：25 米的Tris ，192 mM的甘氨酸）
加入200毫升甲醇（?F 伊纳勒浓度：10％）
将ddH 2 O加到2 L
储存在4°C
SDS-PAGE运行缓冲液（1 L）
在900 ml ddH 2 O中添加100 ml 10 ×SDS-PAGE运行缓冲液

5％印迹级别的阻滞剂
在PBST中溶解5％印迹级别的阻滞剂（w / v）

PBS（1升）
在900 ml 10 ×PBS中加入100 ml 10 ×PBS

PBST
0.1％TWEEN ? 20（V / V）中的1×PBS

缓冲液E（1升）
一种。在800 ml ddH 2 O中加入50 ml pH 7.2的1 M HEPES-KOH，70 ml 1 M KOAc 和0.5 ml 1 M Mg（OAc ）2

b。在缓冲液中溶解45.54 g山梨糖醇和1.9 g EGTA钾

C。调节至1 L

d。过滤缓冲区

e。分装成小体积，并在-80°C下储存

F。在使用前添加1 × 浓度和5 mM DTT的蛋白酶抑制剂

裂解缓冲液
添加0.5％的Triton ? X-100，1 × 蛋白酶抑制剂和1mM DTT中KHM缓冲

储备溶液
10×PBS，pH 7.4（2升）
将160 g NaCl ，4 g KCl ，28.8 g Na 2 HPO 4 和4.8 g KH 2 PO 4 溶于1.9 L ddH 2 O
用NaOH将pH调节至7.4
将ddH 2 O加到2 L
通过高压灭菌器灭菌并保存在RT中
10×SDS-PAGE运行缓冲液（1 L）
将30.3 g Tris，144.4 g甘氨酸和10 g SDS溶于1 L ddH 2 O
存放在RT
1 M KOAc （1升）
溶解98.14 g乙酸钾1 L ddH 2 O
通过高压灭菌器灭菌并保存在RT中
1 M HEPES-KOH，pH 7.2（1升）
将238.3 g HEPES溶于0.5 L ddH 2 O
用KOH调节pH到7.2
将ddH 2 O加到1 L
存放在RT
1 M镁（OAc ）2 （1升）
将155.41 g Mg（OAc ）2 溶于1 L ddH 2 O
通过高压灭菌器灭菌并保存在RT中
1.5 M Tris-HCl，pH 8.8（1升）
将181.7 g Tris溶于0.8 L ddH 2 O
用HCl调节pH值至8.8
将ddH 2 O加到1 L
通过高压灭菌器灭菌并保存在RT中
1 M Tris-HCl，pH 6.8（1 L）
将121.1 g Tris溶于0.8 L ddH 2 O
用HCl将pH调节至6.8
将ddH 2 O加到1 L
通过高压灭菌器灭菌并保存在RT中
10％SDS（100毫升）
将10克SDS溶于90毫升ddH 2 O中
存放在RT
10％APS（50毫升）
将5 g SDS溶解在50 ml ddH 2 O中
储存在4°C
3％NaN 3 （50毫升）
将1.5 g NaN 3 溶于50 ml ddH 2 O
存放在RT
40 mg / ml洋地黄皂苷（10 ml）
将400 mg洋地黄皂苷溶解在10 ml ddH 2 O中
等分试样的体积为30μl ，储存在-20°C
100×蛋白酶抑制剂（1毫升）
将2种蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂溶于1 ml ddH 2 O
等分试样的体积为30μl ，储存在-20°C
500 mM DTT（1毫升）
将0.077 g DL-二硫苏糖醇溶于1 ml ddH 2 O
等分试样的体积为30μl ，储存在-20°C
ATP再生系统（20毫升）
在20 ml 1 × KHM中溶解2.04 g磷酸肌酸，40 mg肌酸激酶，101.44 mg ATP
分装小份样品并储存在-80°C
10 mM GTP（20毫升）
将113.43 mg ATP溶于20 ml 1 × KHM中
分装小份样品并储存在-80°C
1毫克/毫升聚乙烯亚胺（100毫升）
将0.1 g 聚乙烯亚胺溶于100 ml ddH 2 O
通过过滤0.22 微米的过滤器
分装小份样品并储存在-80°C

致谢

该协议是根据先前报告中描述的先前工作进行修改的（Kim 等人，2005; Yuan 等人，2017 ; Ma 等人，2018; Niu 等人，2019）。这项工作得到了香港研究资助局的资助。YGYG的资助金26100315、16102218、16103319和16101116是HHMI在2009-2013年期间的博士后研究助理。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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