材料和试剂

TR ansfer吸管，3米升（亨氏Herenz ，目录号：1131303）
网眼训练器，直径12-15厘米（孔径应小于斑马鱼胚绒毛直径，约0.5毫米网眼）
培养皿（PLP，目录号：S9014UV20 ）
封口膜
带灯丝的薄壁硼硅酸盐，1.0毫米x 0.78毫米x 15厘米（SDR Scientific，目录号：30-0039 GC100TF-15）
Microloader 移液器吸头（Point of Care Diagnostics Pty Ltd，目录号：EPP5242 956.003）
康宁方菜，245 mm 未处理（Corning，目录号：38020 ）
纸巾
多孔组织培养板，6 - 阱和12 - 阱（Interpath ，格雷纳，目录号小号：657160，665180）
Cuvettes（Bio -R a d，货号：2239950）
繁殖/交配槽，3 L（Techniplast ）
野生型斑马鱼（Danio rerio ）
大肠杆菌-GFP细菌（ATCC，目录号：25922GFP）
琼脂细菌学等级（Astral Scientific，目录号：J637-500）
N-苯基硫脲，PTU（Sigma - Aldrich，目录号：P7629-10G）
苯佐卡因（Sigma - Aldrich，目录号：E1501-100G）
氯化钠（Astral Scientific，目录号：0241-5kg）
氯化钾（Sigma - Aldrich，目录号：P9541-500G）
氯化钙2· 2H 2 O（Sigma - Aldrich，目录号：C3306-250G）
MgSO 4 · 7H 2 O（Sigma - Aldrich，目录号：63138-1KG）
亚甲蓝（Sigma - Aldrich，目录号：M9140-25G）
氢氧化钠
磷酸盐缓冲盐水-PBS 片剂（Astral Scientific，目录号：AME404-200TABS）
Triton X-100（Sigma - Aldrich，目录号：X100-500 ML ）
蓝胶
BD 的Bacto TM 胰蛋白胨大豆肉汤（大豆-酪蛋白消化物培养基）（流式细胞迪克在儿子，目录号：211825）
氨苄西林，100 mg / ml ，成品溶液（Sigma- Aldrich，目录号：A5354-10ML）
Milli-Q或蒸馏水
酚红，0.5％，液体，无菌过滤（Sigma- Aldrich，目录号：P0290）
矿物油（Sigma- Aldrich，目录号：M5904-5ML）
60 x E3介质（请参阅食谱）
E3媒体（请参阅食谱）
亚甲蓝原液（请参阅食谱）
含有0.3 mg / L 亚甲蓝的E3 （请参阅食谱）
PTU库存，0.3％（w / v）（请参阅食谱）
包含0.003％（w / v）PTU的E3 （请参阅食谱）
苯佐卡因储备溶液（请参阅食谱）
10 x PBS储备溶液（请参阅食谱）
PBS （请参阅食谱）
PBS中的1％Triton X-100 （请参阅食谱）

设备

1 L和2 L玻璃瓶
磁力搅拌棒– PTFE圆柱形15 毫米长x 6 毫米直径（PLP，Cowie，目录号：001.115.6）
Eppendorf管架
移液器，100-1000 微升，20-200 微升，2-10 微升，0.5-2 微升
钟表制造商镊子，尖头镊子，样式5，114毫米（ProSciTech ，目录号：T65-SA）
孵化器，28 °C（Sanyo，目录号：MIR-162）
培养箱，37 °C（Thermo Scientific，Hereaus ，目录号：B6030）
摇动培养箱（200-225 rpm）（Infors HT Multitron 标准培养箱）
分光光度计（Bio -R ad SmartSpec Plus分光光度计，目录号：273BR03695）
微量移液器拔针器（Sutter仪器，目录号：P-97 ）
本生灯
Atherton Chipmunk高压灭菌器
移液泵
微型离心机（Thermo F i s her Scientific Pty Ltd，目录号：75000461）
微量离心机（Thermo Fis her Scientific Pty Ltd，目录号：THR75002410）
MAGNETI Ç搅拌器（Ratek 仪器私人有限公司，目录号：MS10）
冰箱，4 °C
微量注射器设置（SDR临床技术，Nanoject II 纳升在Jecto ，目录号：690131，脚踏开关，目录号：690140，支座; 目录号：690141，微管支架套件选项，目录号：M-PIP-试剂盒）
带光源的立体解剖显微镜（尼康，目录号：SMZ745）
荧光显微镜（奥林巴斯，型号：MVX10，带DP72相机）
组织裂解仪II（Qiagen ，型号：85300）
油烟罩

软件

图形P 一个d P RI SM 8（http://www.graphpad.com）
ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/index.ht ml）

程序

准备胚胎
晚上将成年斑马鱼（一头雄性和两只雌性）转移至一个3 L的繁殖池中，以使其适应环境，然后在第二天早晨用光刺激交配。
收集胚胎从使用罐网状过滤器，并将其转移到10厘米的P 含有25 ETRI菜米升E3媒体用0.3毫克/ 大号亚甲蓝。
除去任何死亡或未受精的卵子（胚胎变黑，因为他们死和需要被利用吸力从移液管移出，然后弃去）从培养皿并传输其余的受精卵在28日举行的培养箱℃。
在24 hpf时，将胚胎转移至含有0.3 mg / L亚甲蓝和0.003％（w / v）1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3培养基中，以防止色素沉着。
[R E放置E3媒体中的菜每日直至72 HPF 。
可以使用尖锐的钟表钳从绒毛膜上解剖出任何在72 hpf （注射日）之前未孵化的胚胎。

胰蛋白酶大豆肉汤制备
称重15克胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）粉末，然后转移到1 L玻璃瓶中。
加入500 米升Milli-Q水中的和磁搅拌棒，并放置在瓶上磁力搅拌器，以允许溶解。
高压釜中加入培养基中于121 ℃，压力400-500 ķ 帕在高压釜（阿瑟顿花栗鼠灭菌）处理1小时30分钟以消毒（MAK Ë 确保玻璃瓶的盖子高压灭菌前被松开）。
灭菌完成后，取出培养基并盖紧瓶盖。
让介质在室温下完全冷却，然后再转移至4 °C进行长期存储（3-4 周）。

胰蛋白酶大豆琼脂-氨苄青霉素板的制备
称取6 g琼脂细菌级和15 g T SB粉到一个1 L玻璃瓶中。
加入500 米升Milli-Q水中的和磁搅拌棒，并放置在瓶上磁力搅拌器，以允许溶解。
高压釜媒体121 在高压釜中进行1℃，压力400-500千帕（阿瑟顿花栗鼠灭菌器）ħ 和30 分钟，以杀菌（MAK Ë 确保玻璃瓶的盖子高压灭菌前被松开）。
一旦消毒，删除媒体并盖紧瓶盖。
允许介质完全加入500之前在室温下冷却下来μ 升氨苄青霉素溶液（100毫克/ 米升），为100的终浓度微克/ 米升氨苄青霉素。
倾大约25 米升TSB琼脂氨苄青霉素下火焰溶液进入10厘米P ETRI菜肴而不产生气泡，并允许他们完全冷却到室温（图1）。
一旦冷却，接近盖P ETRI菜，密封用石蜡膜和储存在4 ℃下用于以后使用。

图1 。胰蛋白酶大豆肉汤（T SB）-琼脂-氨苄青霉素（Amp）板的图像

细菌培养与列举
接种大肠杆菌-GFP细菌进入10 米升补充有10胰蛋白酶大豆肉汤的μ 升100毫克/ 米升氨苄青霉素。
成长此细菌Ç 37 ulture过夜在振荡培养箱℃下1.1 - 1.4克。
传送1 米升的细菌培养物根据到试管，并装在先前针对未接种的TSB消隐分光光度计，并使用吸光度600nm到确定菌落形成单位（CFU）的Biorad SmartSpec 加OD 600 吸光度测定。
执行细菌培养物的系列稀释（10倍系列稀释10之间-6 10和-10 ，在9 1毫升细菌培养物的毫升TSB未接种的），电镀50-100 μ 升稀释液到TSB琼脂氨苄青霉素平板并将平板在37 °C的培养箱中孵育过夜，以确定肉汤中CFU的确切数量。
以13,751 x g f 或1-2 分钟沉淀细菌细胞，并除去上清液。
重悬STERI细菌细胞勒PBS在〜9 x的浓度10 10 CFU / 米升基于所述分光光度法。
将细菌细胞显微注射到胚胎中
使用微量移液器拔针器将薄壁精密硼硅酸盐玻璃毛细管制成细针（装入硼硅酸盐玻璃毛细管后，按以下设置拉动针头：h –365，–45，速度–80，时间–150和压力- 500 ，然后按下拉按钮，使针）。这些变量设置的增量因每种设备而异（https://www.sutter.com/manuals/P-87_OpMan.pdf）。
使用前，将针头放在带有Blu-tack的正方形板/盘上，以防止其破裂。
通过混合4准备注入材料μ 升〜9× 10 10 CFU的细菌-PBS悬浮液用1 μ 升2％（W / V）的酚红以允许注射物可视化。
使用微加载吸管，装入3针的宽端μ 升含有酚红的注射材料。
摇动针头，将注射材料带到针头的尖端，并清除气泡。
打开空气源和微型注射器，然后将针头转移到微型注射器源中，并牢固地固定在外壳内。
将微操纵器调整到正确的位置，以便在注射时进行微调，使针头靠近注射阶段和注射区域。
Anesthesize 72个HPF 胚胎用0.1mg / 米升在E3媒体苯佐卡因和转移P ETRI菜显微注射阶段。
使用锋利的钟表制造商的镊子将显微注射针的尖端弄破，使细菌细胞易于排出，释放出稳定的量，并能以最小的伤害刺穿胚胎。
可以通过将材料注入矿物油滴中，在比例尺上测量注入液滴的直径并计算体积来确定注入溶液的体积。可以通过更改注射器压力和/或针尖来调节体积。
微型注射器完全安装后，将胚胎对准针尖。
将针尖刺入72个hpf 胚胎的静脉回流中（图2），并使用脚踏板将2-5 纳升（nl ）的注射溶液注射到每个胚胎中，重复进行直到注射所需数量。
注意：针尖的质量对于进行持续注射不会造成不必要的损害至关重要。

图2. 72 hpf 胚胎的图像，其中大肠杆菌-GFP细菌被注入静脉回流（箭头所示）。刻度条S = 200 微米。

一旦注入，放置在一个胚胎P 含有新鲜培养基E3用0.3 mg / L的亚甲基蓝和0.003％的PTU 15分钟，以恢复它们转移到一个28之前ETRI菜℃培养箱中。
在进行注射测定时，每个实验组应至少有30-60个胚胎，包括无菌PBS注射和未注射的对照（图3）。

图3 。组的图像的未注射的胚胎（A）和那些与注射大肠杆菌-GFP细菌（B）。刻度条S = 500 微米。

显微注射后，除去任何死或变形的胚胎和未- 从板注射的幼虫。
为了确定每个胚胎注射的CFU的实际数量，应将五个注射的胚胎匀浆并直接铺在TSB-Agar-Amp板上，然后在37 °C 下过夜生长，然后计数CFU。

注射胚胎的成像
转移注射的胚胎至12 - 井或6 - 孔板成像。
甲nesthetize 胚胎用含有0.1M E3媒体克/ 米升苯佐卡因和定向它们在所需的角度进行成像使用奥林巴斯C ELL 小号ENS 标准软件用奥林巴斯MVX10荧光显微镜ë （奥林巴斯，型号：MVX10用LH100HG和将U-MGFPA / XL GFP镜滤镜连接到DP74相机进行摄影）。
ř EPEAT 此以规则的时间间隔，如0，4，8，16，24和48 ħ 感染后（HPI ），以监测GFP阳性的感染和发病率的大肠杆菌细菌（图4）。
要确定相对存活率，请根据无心跳的目视检查胚胎，以确定死亡的胚胎数量。

图4.在72注射的胚胎的照片HPF 与大肠杆菌-GFP细菌和在0.1可视化HPI （A）和48 HPI （B）。刻度条S = 200 微米。

通过平板计数进行细菌计数
用于细菌计数，收集10个住在每个时间点（例如0，4，8，16，24和48注入幼虫HPI ）分别使用移液管后安乐死与50的过量的Eppendorf管微克/ 米升苯佐卡因在E3媒体。
取出所有E3介质，在新鲜的E3介质中冲洗一次以除去所有苯佐卡因。
转让1 ，000 微升1％的Triton X-100在无菌PBS溶液到管上。
在Qiagen 组织裂解仪II中以30 s的频率均质5分钟。如果需要，重复匀浆5分钟以确保胚胎完全分解。
板50-100 微升匀浆到TSB琼脂氨苄青霉素平板孵育在37 ℃下进行长达48小时，在感染的每个时间点，以确定每幼虫CFU（图5）的数量推导出感染动力学。
通过在荧光显微镜下观察它们，确认TSB-琼脂-氨苄青霉素平板上大肠杆菌-GFP细菌的生长（图6）。

图5 。TSB-琼脂-Amp 平板图像，用于量化胚胎中的大肠杆菌-GFP CFU

图6 。TSB-Agar-Amp平板上的大肠杆菌-GFP细菌菌落的荧光图像。刻度条S = 500 微米。

数据分析

可以手动计算板中的细菌菌落，也可以使用ImageJ插件“分析颗粒”进行计数，如下所示：
用菌落打开细菌平板的图像。
通过选择椭圆形或椭圆形或使用徒手工具绘制感兴趣区域来选择感兴趣区域。
清除感兴趣的外部区域– 编辑> 清除外部。
将它们转换为16位灰度图像– 图像> 类型> 16位。
调整图像阈值– 图像> 调整> 阈值，然后将阈值调整到所需水平后单击应用。
如果菌落很拥挤，并且分离得还不够好，请遵循– 处理> 二元> 分水岭。
算colonies- 分析> 分析颗粒，在弹出窗口中选择像素（10-10的大小，这取决于细菌菌落的大小000）和圆度（0.00-1.00），检查框“显示结果”，“清除结果”，“汇总”和“添加到管理员”。这将提供菌落数量和所选菌落的概述。
使用GraphPad Prism 8软件分析通过平板计数和感染的胚胎存活所列举的细菌载量。
细菌负荷数据可以分析，采用非参数配对学生牛逼-测试和受感染的胚胎存活率可以显示为的Kaplan-Meier曲线，具有统计学意义采用对数秩（曼特尔-Cox）检验确定。

菜谱

60 x E3介质
34.8 g NaCl
1.6克KCl

5.8克CaCl 2 ·2H 2 O

9.78 g氯化镁2 ·6H 2 O

为了制备60 X 股票，溶解在Milli-Q成分瓦特亚特，向2升的最终体积

用NaOH将pH调节至7.2并对其进行高压灭菌（温度：121 °C，压力：400-500 KPa，持续时间：1.5 h ）

在室温下储存长达一年

E3媒体
d ilute 16.5 米升60的X 股票至990 米升用Milli-Q水

在室温下储存长达一年

亚甲蓝原液
将0.1 g亚甲蓝粉末添加到100 ml l Milli-Q水中并混合

在室温下储存长达一年

含有0.3 mg / L亚甲蓝的E3
添加600 μ 升亚甲蓝原液至1L E3媒体

在室温下存放最多1年

PTU库存[ 0.3％（w / v ）]
将0.3 g PTU 添加到100 ml E3介质中

在65 °C 溶解过夜

在室温下储存长达一年

E3包含0.003％（w / v）的PTU
将990 万升E3介质添加10 万升0.3％（w / v）PTU储备液

如果晶体含量为0.3 ％PTU，则在烤箱中于65 °C 孵育溶液直至溶解

奔驰ocaine储备溶液[ 10％（w / v的）]
10克苯佐卡因粉末添加到100 米升100％乙醇（在通风准备罩）

存放在黑暗中，用铝箔纸包裹

10x PBS股票
将100片PBS片剂溶解在1升Milli-Q水和高压釜中（温度：121 °C，压力：400-500 KPa，持续时间：1.5 h ）

在室温下储存长达一年

PBS
100添加米升10的X PBS至900 米升Milli-Q水和高压釜（温度：121 ℃，PRESSUR E：400-500千帕，持续时间：1.5小时）

在室温下储存长达一年

PBS中含1％Triton X-100
加入1 米升的Triton X-100至99 米升无菌PBS

在4 °C下存储长达1年

致谢

笔者小号识别支持一个的迪肯大学国际研究奖学金（FB）。作者要感谢迪肯大学动物馆的工作人员出色的水族馆管理工作，这些工作是本出版物中所述工作的基础。该方案改编自以前的工作（Fehr 等人，2015；Basheer 等人，2019 ）。

利益争夺

作者没有竞争利益。

伦理

迪肯大学动物伦理委员会（G23 / 2016，31 /10 / 16- 31/1/20 20 ）批准了所有涉及动物的研究。

参考文献

晃，S.，植松，S.和竹，O.（2006）。病原体识别和先天免疫。Cell 124（4）：783-801。
Basheer，F.，Rasighaemi ，P.，Liongue ，C.和Ward，AC（2019）。斑马鱼粒细胞集落刺激因子受体在整个生命过程中均保持中性粒细胞数量和功能。感染免疫87 ：e00793-18 。
贝内特，CM，Kanki ，JP，罗得岛，J.，刘，TX，爪子，BH，基兰，MW，兰根，DM，德·莱希-Brown，A.，Zon的，李，弗莱明，MD 和外观，AT （2001 ）。髓细胞在斑马鱼，斑马鱼。血液98（3）：643-651。
Deng，Q.，Sarris，M.，Bennin ，DA，Green，JM，Herbomel ，P.和Huttenlocher ，A.（2013）。局部细菌感染通过斑马鱼中的Cxcr2信号传导诱导嗜中性粒细胞的全身活化。Ĵ Leukoc 生物化学93（5）：761-769。
Ellett ，F.，Pase ，L.，Hayman，JW，Andrianopoulos ，A.和Lieschke ，GJ（2011）。mpeg1启动子转基因指导斑马鱼中的巨噬细胞谱系表达。血液117（4）：e49-e56。
Fehr，A. ，Eshwar，AK，Neuhauss ，S.C 。，Ruetten ，M.，Lehner，A.和Vaughan，L.（2015年）。评价斑马鱼模型研究机会性病原克罗诺杆菌的发病机制。新兴微生物感染4（5 ）：e29 。
Gratacap ，RL和Wheeler，RT（2014）。斑马鱼用于真核病原体- 宿主相互作用的活体内研究。Dev Comp Immunol 46（1）：108-115。
Gray，C.，Loynes ，CA，Whyte，MK，Crossman，DC，Renshaw，SA和Chico，TJ（2011）。使用新型转基因斑马鱼同时进行巨噬细胞和嗜中性粒细胞行为的活体内成像。血栓Haemost 105（05）：811-819。
Hall，CJ，Flores，MV，Oehlers ，SH，Sanderson，LE，Lam，EY，Crosier，KE和Crosier，PS（2012）。斑马鱼中造血干细胞和祖细胞隔室的感染响应性扩展取决于诱导型一氧化氮。CEL 升小号TEM Ç ELL 10（2）：198-209。
Herbomel ，P.，Thisse ，B。和Thisse ，C。（1999）。斑马鱼胚胎中早期巨噬细胞的发生和行为。发展126（17）：3735-3745。
Liongue ，C.，Wright，C.，Russell，AP和Ward，AC（2009）。粒细胞集落刺激因子受体：刺激粒细胞生成等等。Int J Biochem Cell Biol 41（12）：2372-2375。
Manz ，MG和Boettcher，S.（2014年）。紧急粒细胞生成。Nat Rev Immunol 14（5）：302 -314 。
Masud ，S.，Torraca ，V.和Meijer，AH（2017）。在发展中的免疫系统中模拟传染病。CURR Ť 运算d EV 生物学杂志124：277-329。
Meeker，ND和Trede ，NS（2008）。免疫学和斑马鱼：催生人类疾病的新模型。开发比较免疫32（7）：745-757。
Panopoulos ，AD和Watowich ，SS（2008）。粒细胞集落刺激因子：稳态和“紧急” 造血过程中的分子作用机理。细胞因子42（3）：277-288。
南澳伦肖和新南威尔士州特雷德（2012）。4.5亿年历史的典范：斑马鱼和脊椎动物的免疫力。DIS 中号Odel等中号ECH 5（1）：38-47。
Varela，M.，Figueras ，A.和Novoa ，B.（2017）。使用斑马鱼对病毒感染进行建模：先天免疫反应和抗病毒研究。抗病毒药ř 上课139：59-68。
Weiss，G. and Schaible ，UE（2015）。巨噬细胞对细胞内细菌的防御机制。Immunol R ev 264（1）：182-203。
CE，Willett，A.Cortes ，A.Zuasti ，AG和Zapata，AG（1999）。斑马鱼的早期造血和淋巴器官发育。Dev Dyn 214（4）：323-336。