材料和试剂

0.22 μ米过滤器（热科学，目录号：595-4520）
培养皿（Fisher Scientific，直径100 毫米，目录号：FB0875712）
清除p 拉斯蒂克升AB 瓦特说唱（VWR，目录号：46610-056）
直或双刃剃须刀（电子显微镜科学，目录号：72003-01）
1.7毫升无菌无菌微管（Olympus Plastics，目录号：22-281S）
P1000移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：02-707-124）
细胞培养板，96 - 井仪（Eppendorf，目录号：0030730119）
成年大鼠获取脑组织（Wistar ，Charles River，目录号：Crl：WI 003，或其他物种/供应商也可接受）
强力胶（乐泰，目录号：1647358）
层粘连蛋白（康宁，目录号：CB-40232）
II型胶原酶（Gibco ，目录号：17101015）
耗尽外来体的FBS（SBI System Biosciences，目录号：EXO-FBS-250A-1）
1x TrypLE Express（Gibco ，目录号：12605-010）
Poly-D-赖氨酸（PDL）（Corning ，目录号：CB-40210）
异氟烷（帕特森兽医，目录号：07-893-1389）
1个DMEM（Corning，目录号：10-017-CV）
1x DPBS（Gibco ，目录号：14040-117）
葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D16-1）
1x Pen-Strep（Gibco ，货号：15140122）
1个HBSS （Corning，目录号：21-022-CV）
氯化钙（Acros Organics，目录号：206795000）
台盼蓝（Gibco ，目录号15250-061）
胞嘧啶阿拉伯糖苷（AraC ）（Sigma-Aldrich，目录号：C1768-1G）
细胞培养级无菌水（Corning，目录号：25055CV）
解剖培养基（请参见食谱）
5x胶原酶，II型原液（请参阅食谱）
1x胶原酶，II型工作溶液（请参阅食谱）
脉络膜丛上皮细胞（CPEC）培养基（请参阅食谱）

设备

1. 啮齿类动物断头台（哈佛仪器，目录号：73-1918）

2. 解剖大鼠，冠状面的脑基质（ Ted Pella，货号：15007）

3. 迪ssecting工具

小剪刀（Roboz Surgical，目录号：RS-5840）
细尖镊子（Roboz Surgical，目录号：RS-4960）
组织钳（Roboz Surgical，目录号：RS-8102）
显微解剖剪刀（Roboz Surgical，目录号：RS-5671）
Micro B one R ongeur （Roboz Surgical，目录号：RS-8306）
4. 血细胞计数器（Fisher Scientific，目录号：0267151B）

5. 理货计数器（VWR，目录号：23609-102）

6. 异氟醚麻醉机（EZ Systems，EZ-150C经典型蒸发器机）

7. 大鼠异氟烷腔（EZ Systems，EZ-178小鼠/大鼠Sure-Seal密封感应腔）

8. 解剖MI croscope（O b jective为2-5x倍率，Omano ，立体声放大显微镜OM 113-1LP）

9. 冷冻离心机（? ? 容纳1.7毫升微管，的Eppendorf，型号：52 15R）

10. 于37孵育的珠浴 °C（Fisher Scientific Isote mp 数字控制水浴锅，型号：205）

11. 倒置荧光显微镜（用于4倍，10倍和20倍放大率的目标，生命科学，Leica DM4000 B LED）

12. 细胞培养CO 2 培养箱（Thermo Scientific ，8000系列带水套的CO 2 培养箱）

13. 生物安全罩（NUAIRE，II级生物安全柜A / B3）

程序

制备
解剖前一天，准备聚D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白包被的细胞培养塑料器皿：

要准备细胞培养塑料器皿，请解冻适量的PDL和层粘连蛋白。PDL和层粘连蛋白的量根据孔的大小而变化。至关重要的是，液膜要覆盖底部的整个表面以及侧壁2-4毫米之间。例如，在96孔细胞培养板中，用微量移液器将0.05到0.1 ml溶液加到每个孔的2-4毫米处。
用无菌细胞培养级水稀释PDL 1:50，并用DMEM稀释层粘连蛋白1:50。无菌水应进行过滤，例如使用Thermo Scientific Barnstead GenPure 净水系统进行过滤。
使用微量移液器向细胞培养板中添加0.05至0.1 ml的PDL，然后在37°C孵育至少4 h，以使PDL覆盖表面。
4小时后，用真空抽吸PDL溶液，然后用无菌细胞培养级水冲洗孔3次。
用微量移液器将层粘连蛋白溶液添加到板上以涂满表面，包裹在萨兰包装中并在4°C下放置过夜。保持孔中充满层粘连蛋白，直到即将细胞混合物铺板之前。

从大鼠大脑收集脉络丛组织
为了便于处理，在开始解剖前，用移液器，TrypLE Express，1x胶原酶，II型工作溶液，HBSS，CPEC培养基和工具建立生物安全罩。
将大鼠放入预装有3％异氟醚/氧气混合物的异氟烷诱导室中以麻醉大鼠。保持异氟烷水平，直到动物完全麻醉。这可以通过捏脚和尾巴来证明。大鼠不应有任何反应，这将在进行之前验证动物是否处于完全麻醉状态。此后，用啮齿动物断头台迅速给大鼠断头。用手握住头部，沿颅骨顶部至鼻尖纵向切割头部顶部的皮肤。横向分离皮肤以露出头骨。使用米ICRO b 一个? ongeurs 从大脑除去周围颅骨，起始于小脑和移动anterio 朝向嗅球河脑切除和随后的解剖应尽快发生，以防止组织退化。为了获得最佳结果，请在1小时以内完成解剖。此外，确保脑组织和样品浸没在解剖培养基中（配方1），包括解剖后存放在冰上的微管中时。
将大脑转移到皮氏培养皿中冷却的大鼠脑基质中（图1A），该皿已在湿冰上放置5分钟，然后继续。用冷的解剖培养基冲洗大脑。在随后的阶段中，组织将被冷却的解剖培养基连续润湿，以保持组织完整性并确保最大的细胞产量。
现在可以使用直刃刀片在两个单独的位置沿冠状平面切割大脑：（1）在隔膜水平（前-后（AP）?1.00 ）和（2）在鼻沟水平（（ ?AP -5.5 ）[参见坐标中引用Paxinos和Watson（1997）]（图1B）。
将包含第4 个心室的后脑部分转移到新的无菌培养皿中，该培养皿中含有一小滴强力胶。将脑块定向在强力胶上，使脑脊神经的一面朝下，小脑和脑干朝上（图1C）。在培养皿中加入冷却的解剖培养基，以完全覆盖大脑块。
将包含侧脑室和第三脑室的中脑部分转移到另一个无菌培养皿中，并在腹侧表面（例如，皮层朝上）上盖上大脑块（图1D）。在培养皿中加入冷却的解剖培养基，以完全覆盖大脑块。
在接下来的步骤中，将培养皿置于解剖显微镜下以确保精确的解剖技术（图1E）。

图1.准备解剖的大脑。A.取出大脑后，放入冰冷的脑基质中。B.将两个直刃剃须刀片插入脑基质以形成三个块：前部[包含嗅球至隔膜的水平（大约AP–?1.0 ）]，后部[包含脑干，小脑和中脑的水平（大约AP–?5.5 ）]，和（3）中心部分。C.胶水后块到的底部P 与脑干（黑色箭头）和小脑（白色箭头）ETRI菜朝上。D.胶中央组块到的底部P 与皮质朝上ETRI菜。E.倒入冷却的解剖介质进入P ETRI盘以浸没解剖显微镜可视化下的脑组块，然后地方。

使用镊子将小脑与脑干精确分离，以显示第四脑室。脉络丛将在该开口内显示为淡红色/粉红色的漂浮组织（图2A）。使用镊子轻轻地去除脉络丛。通过显微镜检查确认未附着脑组织；脉络丛的可视化（例如，浅红色/粉红色样的外观）将不同于脑组织（例如，白色/灰色组织）（图2B ）。如果任何脑组织附着在脉络丛上，请用镊子小心地从目标脉络丛组织中取出组织。最好收集较少的组织并确保脉络丛样本是纯净的，而不是收集可能污染培养中细胞群体的多余组织区域。将样品放入带有解剖培养基的1.7 ml 微管中，盖上盖子，并保存在冰上。

图2。第四脑室脉络丛的解剖。A.用细尖镊子将脑干与小脑轻轻分开。这将揭示第四脑室腔并暴露内部脉络丛组织。B.轻轻拉动脉络丛组织，将其从第四脑室中取出。它将显示为红色和浅粉红色（白色箭头）。

对于侧脑室脉络丛和第三脑室脉络丛的解剖，请使用直刃刀片沿纵裂轻轻切开the体（图3A）。但是，请不要完全切开P etri碟的底部；切开call体，露出第三脑室。如果切得太深，第三脑室脉络丛组织将难以可视化并与脑组织隔离。
轻轻地用镊子将皮层和海马从侧面拉至任一侧，以沿中线暴露背侧第三脑室脉络丛（图3B），这将显示为淡红色/粉红色的漂浮组织在该区域的中心折叠。轻轻拉出脉络丛组织（图3C），确认未附着脑组织（图3D），将样品放入带有解剖培养基的1.7 ml 微管中，并保存在冰上。当移除组织，确保不通过使用精确的解剖技术（图拉从其他地点脉络丛小号4A- 4 F）。根据冠状切口相对于其他脑部结构的位置，侧脑室脉络丛可能会混淆背侧第三脑室脉络丛组织。来自背侧第三脑室的脉络丛将是收集的最小组织，因为它仅位于中线，正好在唇状区域上方。因此，如果在从心室区域分离时拉出一长串脉络神经丛，则更可能是侧脑室的脉络丛组织，如果在S tep B 9（s ee图s 6A- 6 B）。因此，如果对您的研究而言至关重要的是保持心室位置之间的区别，则由于定位不明确，可能无法使用该样本。

图3.第三脑室脉络丛的解剖。答：用一把直刃剃刀沿着矢状裂隙轻轻分开半球。B.分开半球的右侧和左侧（包含皮质和海马体）以显示背侧第三心室脉络丛，其颜色将显示为浅粉红色/红色（黑色箭头）。C.大脑冠状位视图显示了背侧第三脑室脉络丛的切除。D.去除的脉络丛（白色箭头）将显示脉络膜组织的结构特征。

图4.第三脑室脉络丛的逐步解剖。A.从两侧分离皮??质组织后，可以直接在中线上看到第三脑室脉络膜丛。白色箭头表示该脉络丛神经组织顶部的位置，看起来呈浅粉红色。B.镊子可以在组织下方轻轻滑动，以使脉络丛（箭头）与周围区域分离。C.脉络丛组织现在应该可以在第三脑室区域内移动。白色箭头标识浮动组织。D.用镊子轻轻地将脉络丛从心室腔中拉出。白色箭头表示在脑块顶部逐渐分离的组织。E.取出后，脉络丛（箭头）不应附着在任何结缔组织上。F.侧视图显示从中线取下第三脑室脉络丛（箭头）。

接下来，要获得侧脑室的脉络膜丛，请在每侧移动海马以露出侧脑室（图5A），然后轻轻拉动脉络膜丛使其从该位置移开（图5B）。脉络膜外侧丛将表现为较长的组织带（图5C）。确认未附着脑组织，并且正确区分了侧脑室和背侧第三脑室脉络丛组织（图s 6A- 6 B）。之后，将样品放入带有解剖培养基的微管中，并保存在冰上。

图5.侧脑室脉络丛的解剖。A.去除第三脑室脉络丛后，将皮层与海马体轻轻分开（黑色箭头标识海马体）。这将揭示这些结构之间的侧脑室脉络丛神经组织（白色箭头表示浅粉红色/红色脉络膜组织）。B.轻轻拉动脉络丛组织，将其从心室腔中取出。白色箭头表示已取出的组织。C.侧脑室脉络丛会比第四个和第三个脑室位置更长，更像字符串。

图6.侧脑室脉络丛和第三脑室脉络丛的差异特征使它们在视觉上能够彼此区分开。A.去除后，外侧脉络膜丛长而呈线状（黑色箭头），而第三脑室脉络丛的大小较小（白色箭头）。B.外侧脉络丛神经组织（黑色箭头）和第三脑室脉络丛神经组织（白色箭头）的可视化。注意大小和外观上的明显区别。

以300 xg 旋转样品3分钟。在生物安全罩中，用微量移液器吸出培养基（请勿抽真空，以免吸出样品）。

组织解离
将TrypLE Express放入珠浴中，以加热至37°C。
在步骤B12吸介质后，立即加入500 μ 升1X胶原酶，II型的用Ca 2+ 工作溶液（配方3）到每个组织样本在37℃下孵育15-20分钟。每五分钟轻拍并轻拂试管一次，总计约60次以破坏组织–不要涡旋。原代细胞对机械应力非常敏感，过度的应力会导致细胞死亡增加。您会看到组织破裂，透明的缓冲液会随着小块组织变浑浊（图s 7A-B）。
在此阶段，通过添加1 ml HBSS冲洗样品。旋管，在300 ×g下2-3分钟，然后吸用P1000吸管尖上清液如下：第一抽吸200 μ 升，再追加200 μ 升，然后最终剩余的上清液。去除尽可能多的上清液，而不接触细胞沉淀。这种方法可以防止从移液器吸头上吸取过多的东西，并且避免吸出样品，这可能会在抽取较大体积时发生。
为了进一步解离的S amples，点击沉淀，加入500 μ 升的的TrypLE 快车。将试管在珠浴中于37°C孵育10-20分钟，每5分钟敲击一次试管。对于细胞的良好可行性，这是小鬼ortant不以OV ER- 消化。因此，用倒置光学显微镜检查微管中的细胞，以验证组织正在分解成小块（图s 7C- 7 D）。
一旦实现了具有单细胞和小团块（包含少于10个细胞）的悬浮液，该过程就完成了。
接着加入500 μ 升CPEC培养基（配方4）。轻轻研磨约六次，以使用P1000移液器吸头将细胞解离，然后缓慢向上，向下快速移液至移液器的第一个停止位。
等待约30秒钟，使大块组织沉淀下来，然后将上清液中的漂浮细胞转移到新的微管中。以300 xg离心3分钟。保留先前在室温下沉淀的大块组织。如果细胞产量较低（请参阅D 部分），请添加CPEC培养基并研磨，重复步骤C 6 。
离心后，吸用P1000吸管尖上清，以500洗涤细胞沉淀μ 升CPEC培养基。为防止沉淀物过度提取，请避免使用真空进行快速漂洗，而应使用微量移液器，确保尖端的末端在沉淀物的另一侧。重悬在新鲜的500 μ 升CPEC培养基中，并重复该步骤两次。
重悬在CPEC介质的标称量的沉淀（约100-200 μ 升）。

细胞计数和电镀
计数细胞，并测定细胞活力（在数据下面描述一个nalysis）。细胞计数对于确保健康细胞具有有效的增殖速率至关重要，这将保证实验的可重复性和准确性。
在即将使用之前，将层粘连蛋白溶液从细胞培养孔中吸出，然后用无菌细胞培养级水冲洗孔3次。接下来，在添加细胞之前，立即用1x DPBS或CPEC培养基冲洗一次。确保不要让孔变干。
要铺板细胞，相应地向细胞培养塑料器皿中添加适当体积的细胞混合物（表1）：

? 能够1.准则为细胞混合物的体积比，以细胞培养板用于

细胞培养板大小

细胞混合物的体积

96 - 孔板中，PDL-涂覆层粘连蛋白

200 μ 升/孔（10000个细胞/孔）

96 - 孔平板

100 μ 升/孔

24 - 孔板

0.5毫升/孔

12 - 孔平板

1毫升/孔

6 - 孔板

2毫升/孔

盖好板并轻轻旋转细胞培养皿，以确保细胞混合物均匀分散在整个孔表面。将盘子放在37°C下过夜。2天后，抽吸CPEC培养基并添加新鲜培养基。每3天继续更换培养基。该操作将清除孔中未附着在孔表面的死细胞碎片。
后3变化汇合将达到? 介质（的< 10天）。汇合后，细胞已准备好调查因子向培养基中的分泌。
培养的细胞将再稳定7天进行实验。

数据一nalysis

如何计算细胞：

计数细胞，将细胞混合物从步骤D3与台盼蓝以1比组合：1（即，15 μ 升细胞混合物：15 μ 升台盼蓝）。使用移液管25施加μ 升的台盼蓝处理的细胞悬浮液的血球。如果使用玻璃血细胞计数器，则轻轻地在盖玻片下填充两个腔室，并由于毛细作用使细胞悬浮液均匀地抽出。
使用显微镜，以10倍物镜聚焦在血细胞计数器的网格线上。
使用手持式计数器计数活的未染色的细胞（活细胞不占用台盼蓝）在一组的16个平方（图小号7E- 7 F）。在开始计数之前，请选择两条边界线（左上或右下），并在计数时保持一致。例如，仅对设置在给定正方形内且在右侧和底部边界线上的像元进行计数。请勿在正方形的左侧或顶部边界线上计数像元，以防止重复计算位于2个正方形边界上的像元。
将血细胞计数器移至下一组16个角点并继续计数，直到对所有4组16个角点进行计数。
记录产量。
为了确定可行性的估计，添加的活的和死的细胞数进行计数在一起以获得总细胞计数（图（死细胞将与台盼蓝染色）小号7E- 7 F）。接下来，将活细胞计数除以总细胞计数值，以获得存活率百分比。

图7.背第三脑室和侧脑室脉络丛的原代细胞培养的组织准备。AB。最初的2分钟内，在1x胶原酶II型中，在离心管内以Ca 2+ 工作液加Ca 2+ 工作液以放大的20x 倍率观察背侧第三脑室（A）和侧脑室（B）脉络丛组织。请注意，脉络丛神经组织在两个位置之间在大小和外观上存在明显的差异。光盘。在1x胶原酶II型中用Ca 2+ 工作溶液在40x 放大倍数下观察15分钟后，观察背侧第三脑室（C）和侧脑室（D）脉络丛神经组织。请注意，较小的组织块和单个细胞更易于区分。英孚在20倍放大率下，在血细胞计数器上观察锥虫蓝解决方案中背侧第三脑室（E）和侧脑室（F）脉络丛神经组织中的细胞。对于活细胞，细胞膜不被染料渗透，因此，细胞看起来清晰且反射（例如，白色箭头为一个例子）。相反，死细胞获得该染料，因此看起来颜色更深，这代表蓝色污点（例如，黑色箭头为一个示例）。

笔记

健康的脉络丛细胞明亮，可折射且清晰。许多浅蓝色细胞的存在可能表明过度消化和/或过度研磨。
预计每只大鼠第三脑室脉络丛的产量约为10,000个细胞，外侧和第四脑室脉络丛的产量约为30,000个细胞。
幼崽的脉络丛细胞比成人小，但它们在1x胶原酶，II型工作溶液中解离的速度更快，并且在TrypLE Express中需要的时间更少（少于20分钟）。
培养初级脉络丛细胞的时间（> 2周）长时间，加入20 μ 中号的阿糖胞苷，以防止成纤维细胞的过度生长。

菜谱

解剖培养基
将1x DPBS与葡萄糖和Pen-Strep混合以创建具有0.6％葡萄糖和1x Pen-Strep浓度的溶液（例如，使1升解剖培养基合并1,000 ml 1x DPBS，6 g葡萄糖和10 ml ，00 0 单位/ ml 的Pen-Strep ）
搅拌直至溶液澄清
用0.22滤波器μ 米过滤器通过螺纹连接的塑料过滤器顶部上的高压灭菌，玻璃容器，最终的解决方案将被存储在。连接所述过滤器顶部至真空并打开真空过滤通过该溶液。过滤可确保溶液的纯度，从而不影响无菌性
储存在4°C
为了获得最佳结果，请在解剖前24小时内制作新鲜的解剖培养基
5x胶原酶，II型原液
在1x HBSS中稀释II型胶原蛋白酶，并补充3 mM CaCl 2 制成最终浓度为7.5 mg / ml的溶液
通过0.22滤波器μ 米过滤器
将2 ml储备溶液分装到2 ml无菌试管中，以储存在-20°C
储备液最多可保存6个月
1x胶原酶，II型工作溶液
以1：5的比例混合5x胶原酶，II型储备液和1x HBSS以及3mM CaCl 2的混合物

脉络膜上皮细胞（CPEC）
结合1X DMEM与FBS和青霉素-链霉素，以实现用10％FBS和1x青霉素-链霉素的浓度（对考试的溶液PLE，使1升CPEC介质的结合900毫升DMEM的用100ml的FBS 和10 ，000单位/ ml Pen-Strep ）
过滤与0.22溶液μ 米音响滤波器
存放在4°C的高压灭菌玻璃容器中

致谢

这项工作得到了CDF 的国立卫生研究院（NIH）（NIDA Grant DP1-DA039658）和VL 的烟草相关疾病研究计划（TRDRP）（Grant T30FT0967 ）的支持。作者已经发表了从这项技术中得出的发现（Lallai et al。，2019），并代表了先前对小鼠组织的报道的技术修改（Barkho and Monuki，2015）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有experi 发言：是在严格按照NIH指南实验室动物的护理和使用进行了与在协议AUP-17-206被批准（许可期12/6 / 2017-12 /2021分之6）b y中的机构动物加州大学尔湾分校护理与使用委员会。

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