材料和试剂

细胞培养耗材
6孔/ 24孔组织培养板，烧瓶，移液器（德国萨尔斯特）
移液器吸头（德国萨尔斯特）
铝箔
CHO-K1（中国卵巢细胞）（ATCC ，目录号：CCL-61）
质粒（pCAGGS ，Niwa 等，1991 ）
DMEM（PAN Biotech，目录号：P04-04500）
EDTA-胰蛋白酶（PAN Biotech，目录号：P10-023100）
不含钙/镁的DPBS（PAN Biotech，目录号：P04-36500）
青霉素/链霉素（10,000 U / ml ）（PAN Biotech，目录号：P06-07100）
FBS（胎牛血清）（PAN Biotech，目录号：P30-3306）
Opti-MEM TM I降低血清培养基（Thermo Fisher，Gibco TM ，目录号：31985070）
TurboFect 转染试剂（热费舍尔，热科学TM ，目录号：R0531）
生长培养基（请参见食谱）

免疫沉淀
乙醇（Sigma，CAS号：64-17-5 ，目录号：34852-1L-M）
Tris-HCl（TRIS盐酸盐）（Carl Roth，CAS号：1185-53-1，目录号：9090.3）
EDTA（AppliChem，CAS号：6381-92-6，目录号：A1104）
焦磷酸钠（Fisher Scientific，Alfa Aesar ，CAS号：7722-88-5，目录号：A17546.30）
氟化钠（Fisher Scientific，Alfa Aesar ，CAS号：7681-49-4，目录号：A13019.30）
原钒酸钠（Sigma ，CAS号：13721-39-6，目录号：S6508-10G）
盐酸苄am（AppliChem，CAS号：1670-14-0，目录号：A1380）
PMSF（AppliChem，CAS号：329-98-6，目录号：A0999）
NEM（N-乙基马来酰亚胺）（Sigma，CAS号：128-53-0，目录号：E3876-5G）
cOmplete TM ，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，Roche，目录号：11873580001）
NP - 40（Thermo Fisher，Thermo Scientific TM ，目录号：85124）
Protein-G- Sepharose 4 Fast Flow（Sigma，GE Healthcare，GE17-0618-01）
抗HA 2 抗血清（Hu 等，2019）
IP缓冲区（请参阅食谱）
细胞裂解缓冲液（请参阅食谱）

SDS-PAGE和W 酯印迹
PVDF 印迹膜，0.2 µm（VWR，Peqlab ，目录号：732-3200）
1.5 ml 微量离心管（德国萨尔斯特）
30％丙烯酰胺/ bisacrylami 德（37.5：1）（卡尔罗斯，目录号：3029.1）
四甲基乙二胺（TEMED）（Carl Roth，CAS号：110-18-9，目录号：2367.3）
过硫酸铵（APS）（Carl Roth，CAS号：7727-54-0，目录号：9592.2）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Carl Roth，CAS号：151-21-3，目录号：2326.4）
溴酚蓝（Sigma，CAS号：115-39-9，目录号：1081220005）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Carl Roth，CAS号：3483-12-3，目录号：6908.2）
甘油（Carl Roth，CAS号：56-81-5，目录号：3783.1）
脱脂奶粉（Carl Roth，CAS号：68514-61-4，目录号：T145.3）
Twee n 20（Carl Roth，CAS号：9005-64-5，目录号：9127.1）
Pierce TM ECL Plus Western印迹底物（Thermo Fisher，目录号：32132）
堆积凝胶解决方案（请参阅食谱）
分离凝胶溶液（请参见配方）
5x非还原装载缓冲区（请参阅食谱）
4x减少加载缓冲区（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见食谱）

交联和点击化学
黑光蓝（UV）灯（三共电气，功率8W，3.5 A，60V，波长320 - 365纳米，图3A）
改进的Photoclick- 胆固醇（图1B，溶于乙醇，将管密封并保存在-20 °C ）。在Hu 等人的文章中详细描述了长合成。（2019）。但是可以从Click Chemistry Tools（https://clickchemistrytools.com/product/alkyne-cholesterol/）购买中间体炔烃。使用这种化合物，可能更容易合成最终产品，即改良的Photoclick- 胆固醇。
Picolyl-Azide-Sulfo-Cy3（Jena Bioscience，目录号：CLK-1178-1）
CuAAC Biomole cule反应缓冲液试剂盒（基于THPTA ）（Jena Bioscience，目录号：CLK-1178-1）

设备

-20°C冷冻室
移液器对照奥勒（赫斯曼Laborgeräte ）
Heracell 240i CO 2 培养箱（Heraeus）
台式离心机（Eppendorf，型号：5424R）
电源组P25（Analytik的耶拿，Biometra公司P25T）
化学发光成像，Fusion SL（PeqLab ）
蓝色恐惧TM 半干电印迹系统（VWR，PEQLAB ，米Odel等：Sedec TM M）
管转子（Carl Roth，ThermoFisher ，型号：ATX1.1）
台风FLA 9 4 00扫描仪（GE Healthcare）（图2）

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图2. 台风FLA 9 4 00扫描仪。将来自第I部分D部分的凝胶（其中包含交联的样品并用ddH 2 O 洗涤）插入两个玻璃板之间，以进行激光扫描。为结果，参见图4 阿和4 乙。

软件

台风扫描仪控制v 5 。0软件（GE ħ ealthcare）
ImageQuant （GE ħ ealthcare）
图片J（斐济）
微软Excel
GraphPad棱镜

程序

第一部分：活细胞中HA的光胆固醇标记

通过转染在CHO细胞中表达HA
见d 0.9 ×10 6 -1.1 X 10个6 CHO细胞进入一个孔的6孔培养板的转染的前一天，例如使得它们达到70-90％汇合第二天。
稀UTE 3微克质粒（pCAGGS中）在300编码HAμ 升无血清的Opti -MEM和通过移液混合。
简言之涡流TurboFect 试剂，并添加6 μ 升至稀释的DNA。立即涡旋混合。
在室温下孵育15-20分钟。
在温育期间，移出旧的细胞培养基并替换为1 ml无血清的DMEM。
将DNA / TurboFect 试剂混合物滴加到细胞培养基中。
轻轻摇动板，以使DNA / TurboFect 复合物均匀分布。
在CO 2 培养箱中于37°C 孵育。

细胞内HA的光胆固醇标记和交联
转染后6 h ，用1 ml 新鲜的无血清DMEM 代替细胞培养基以去除转染试剂。
加入5 μ 升pH值otocholesterol （从5毫克/米升乙醇股票，其被存储在-20 ℃下，网络连接最终浓度：50 μM ）到每个孔中，轻轻地摇动平板，以实现均匀的分布。
在CO 2 培养箱中于37°C孵育，直至下一步。
转染后24小时，用1 ml 新鲜的无血清DMEM 代替细胞培养基，以除去漂浮在培养上清液中的死细胞。
只要可以保护“ UV灯/ 6孔板/冰盒”免受光照，就可以将板放在冷藏室（〜8°C，图3B）中或冰上。低温会减慢脂质在膜内的迁移，并阻止蛋白质的构象变化，因此更适合于后续的交联。
因为塑料会吸收紫外线，所以请从盘子和紫外线放大器上取下盖子（图3C）。
将紫外线灯直接放在6孔板的顶部，打开紫外线灯（波长320-365 nm，功率8 W，3.5 A，60 V），使细胞在黑暗中暴露于紫外线下10-20分钟激活重氮基团以触发交联（图3D）。所述细胞仍附着到6孔培养板中，用1 m的覆盖升在此阶段无血清DMEM。在照明过程中戴防护用的Google。

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图3.与光胆固醇的交联。A.紫外灯（波长320-365 nm，功率8 W，3.5 A，60 V）。B.冷藏室（Tm：〜8°C）。C.从组织培养板和紫外线灯上取下盖子，在紫外线照射前进行准备。D.在黑暗中用紫外线照射培养板。

HA的免疫沉淀（缓冲液应该是冷的，并且程序应在4 °C下进行）
暴露于紫外线后，细胞仍附着在6孔培养板上，并被DMEM覆盖。将6 孔板放在冰上，通过刮擦分离细胞，而无需更换培养基。
将细胞转移到1.5 ml 微量离心管中，并在4 °C下以1200 x g 离心5分钟。
洗涤细胞沉淀一次用1M 升PBS重悬在500细胞μ 升细胞裂解缓冲液。
在4°C下将细胞裂解30分钟，然后在4°C下以最大速度（13,500 rpm / 17,000 x g ）离心15分钟，以去除不溶物。
将上清液转移到新的1.5 ml 微量离心管中，而不会干扰沉淀。
除去50 μ 升从裂解物用于通过蛋白表达的分析W¯¯ 西部时代印迹。添加12μ 升5×非还原加样缓冲液，这50个μ 升溶胞产物，孵育95℃5分钟，然后储存在-20℃。
抗HA添加2 抗血清（1：1000）到剩余的450 μ 升溶胞产物并孵育在4 ℃下搅拌过夜（12-16 在冷室小时）。
P repare的蛋白质G-工作液琼脂糖凝胶根据制造商的说明书珠。
蛋白质-G- 琼脂糖浆的库存储存在乙醇中。因此，将原液以12,000 xg离心30秒钟以除去乙醇。
W¯¯ 灰蛋白-G- 琼脂糖珠一次，用PBS通过添加PBS的相同体积的珠和离心机以12,000 ×g离心30秒。
ř esuspend 蛋白质-G- 本身pharose 珠在PBS中通过添加PBS的相同体积（1：1倍稀释）。
加入50 μ 升的蛋白G-的琼脂糖珠到每个样品中并孵育在4℃下对另一个4 h中的冷室中搅拌。
以12,000 xg离心30 s沉淀HA /抗体/蛋白质-G- 琼脂糖复合物。
除去上清液和洗复杂两次用1 米升用IP缓冲液，然后两次1 米升PBS，以排除从化学品IP-缓冲器影响在下一步骤中，点击化学反应（在第I部分中描述的可能性科d ）。出于同样的原因，在最后一次用PBS洗涤后，应尽可能完全除去液体。
尽快进行点击化学反应（在第I 部分D 部分中描述）。将HA /抗体/蛋白质-G- 琼脂糖复合物在冰上保存1 小时是可以的，但不建议保存更长的时间（例如，在-20 °C 过夜）。

（Cu（I））催化的叠氮化物- 炔烃点击化学反应（CuAAC ）根据制造商的说明
制备储备溶液在DDH 2 ○：250毫THPTA，100mM的硫酸铜4 ， 1M的钠抗坏血酸。当所有试剂都是新鲜制备时，反应效率更高。
制备Picolyl-Azide-Sulfo-Cy3（2 mM，溶于H 2 O，红色）的储备溶液。
为每个实验新鲜准备CuSO 4 ：THPTA- 预混物（摩尔比为1：5）。6 μ 升（2 μ升的CuSO 4 + 4μ 升THPTA）混合物在这里用于各反应。（CuSO 4 ：THPTA 的比例在制造商的说明中建议为1：5，但可以更改。）
重悬HA /抗体/蛋白G ^ - 琼脂糖在164μ复杂升H的2 O.
向混合物中加入10 µl 2 mM的Picolyl-Azide-Sulfo-Cy3，然后通过移液混合。
注意：此处添加的叠氮基-Cy3的量是根据标记免疫沉淀的HA的量进行调整的。相同的终浓度光胆固醇（50 µM）用于HA标记。在点击化学反应中炔烃：叠氮化物的摩尔比为1：4，可以对其进行调节以获得更好的结果。比率越高，荧光信号越强。在制造商的说明中建议比例为1:10。

向混合物中加入6 µl CuSO 4 ：THPTA- 预混物，然后通过移液混合。
向混合物中添加20 µl 抗坏血酸钠，以使每个反应的最终体积为200 µl 。通过移液混合。
每隔10-15分钟将样品在室温下温育1小时，然后缓慢混合（避免涡旋）。将试管包裹在铝箔中以保护样品免受光照。
洗液样品用1 米升PBS（至少4倍），直到没有红色从叠氮基的Cy3的被认为是在上清液中。但是，不建议对珠子进行大量清洗，因为在每个清洗步骤之后，珠子的数量会略有减少。
将样品重悬于40 µl 1x还原负载缓冲液（从ddH 2 O中的4x还原负载缓冲液中稀释）中，并在95°C下孵育5分钟。
运行SDS-PAGE。
定期更换（例如每次10分钟），并用ddH 2 O 洗涤凝胶至少1 h 。有时需要整夜（> 12 小时）洗涤，以减少未偶联的Picolyl-Azide-Sulfo-Cy3产生的背景信号。
用生物分子成像仪（Typhoon FLA 9400扫描仪，对于Cy3 ，激发= 550 nm，发射= 560 nm ）扫描凝胶。
注意：不应更改步骤s D4 - D7 的顺序。

第二部分：免疫沉淀HA的光胆固醇标记

转染CHO细胞以表达HA，如P art I的A 部分所述。转染后24小时，用HA HA的抗HA 2 抗血清免疫沉淀的HA，如P art I的C 部分所述，然后进行交联。

免疫沉淀HA和光胆固醇之间的交联：

将洗涤过的HA /抗体/蛋白-A- 琼脂糖复合物重悬于100 µl PBS中。
加入0.5 µl光胆固醇（从溶于乙醇的5 mg / ml 储备液中，最终浓度：50 µM），并通过移液混合。将溶液转移到24孔板的一个孔中，从而形成覆盖孔底部的薄液体层。
将样品暴露在紫外线下（见图3）。
所述标记的蛋白质转移到微量离心管中，并用1洗两次混合物米升IP缓冲液1，然后两次米升PBS。
进行到点击化学反应如上述节的d P 技术I.
第三部分：Western blot检测HA的表达水平

准备用于SDS-PAGE的凝胶。堆积凝胶中丙烯酰胺的浓度为4％，而分离凝胶中丙烯酰胺的浓度为12％。
在恒定电压下运行SDS-PAGE。当蛋白质在堆叠凝胶中时，请使用低电压（80-100 V），在分离凝胶中请使用高电压（160 V）。
使用半干转移系统将蛋白从SDS凝胶转移到200-220 mA的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上1小时。
注意：时间可以根据所研究蛋白质的分子量进行调整。较大的蛋白质需要更长的转移时间。

在室温下，将膜与封闭溶液孵育30 分钟。
将膜与一抗（抗HA 2 抗血清，在封闭溶液中以1：1,000稀释）在室温下孵育2小时，或在4 °C过夜（12-16 小时）。
在定轨摇床上用PBST （请参阅R ecipes）将膜清洗4次（每次5分钟）。
将膜与偶联辣根过氧化物酶的二抗（在封闭溶液中以1：5,000的稀释度）在室温下孵育1小时。
重复第三部分中的步骤6 。
根据制造商的应用ECL Plus试剂至膜“ S代码，其与辣根过氧化物酶反应以得到化学发光信号。
使用Fusion SL摄影机系统检测蛋白质。

数据分析

为了定量分析结合强度，使用Image J（Fiji）软件分析了W 酯印迹和荧光图。计算缺少胆固醇结合位点的HA突变体的光交联（荧光图）与蛋白质表达的比率（W 酯印迹），并将结果标准化为HA野生型的值（HA - wt ，设置为100 ％）。
有关使用Image J的详细说明，请访问https://imagej.net/ImageJ。在这里，我们简要描述量化过程（参见图4C）。1）确保频段水平对齐。2）从空载体转染的细胞中减去背景信号。3）选择频带[ 在图4C（b）中左侧面板和第二面板在图4C（c）中] 。4）绘制带，绘制直方图，指示每个带的强度[ 图4C（b）中的中间面板和图4C（c）中的第三面板] 。5）画线以密封每个直方图。6）选择“魔术棒”按钮，然后在每个直方图内部单击，这将在新的“结果”窗口[ 图4C（b）和图4C（c）中的最后一个面板中给出一个值，指示分析带的强度。）] 。值导出为csv。文件并由Microsoft Excel分析（请参见表1）。相对于HA-wt，将胆固醇掺入缺乏胆固醇结合位点的HA突变体中减少到34％。

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图4.图像处理。A- B。将扫描仪的电压从600（A）增加到800（B）会增加对比度。分子量显示在左侧。接下来的三个泳道（L1，L2和L3）是用空载体转染的细胞（模拟），表达缺少胆固醇结合位点的HA突变体的质粒（HA突变体）和表达野生型HA的质粒（HA- wt ）。扫描可被导出为TIF - 文件，并用图像评价J. C. 通过图像处理的图像Ĵ（斐济）。（a）图像J（斐济）的工作面板。（BC）HA-突变体和HA的条带强度进行定量- 重量从荧光扫描仪（b）和w ^ 西部时代印迹（C）。确定黄色框中的条带密度，并为每个峰计算曲线下的面积。减去从用空载体（模拟物）转染的细胞获得的结果，并计算光胆固醇相对于HA突变体相对于HA- wt 的相对掺入（表1）。

表1 。数据处理以比较光胆固醇与HA- wt 掺入HA突变体中（一个例子）

带强度

-嘲笑

突变体/ wt （％）

嘲笑

4,596.9

62.2％

荧光性

HA-MUT 蚂蚁

30,246.0

25649。1个

重量

45,830.8

41,233.9

嘲笑

1,378.3

183.0％

免疫印迹

HA突变体

48,514.1

47,135.8

HA- 重量

27,134.8

25,756.5

Fluro / 白平衡

34.0％

笔记

由于膜中的胆固醇浓度非常高（质膜中高达50％），并且由于脂质和蛋白质都在膜内移动，因此每个跨膜区域都可能与胆固醇短暂接触。因此，原则上每个跨膜蛋白都可以与光胆固醇交联，特别是如果它被强烈表达的话。为了排除这种“非特异性”相互作用，建议包括一个假定的胆固醇结合位点发生突变的突变体。在HA标记的情况下，相对于wt HA，具有位点交换的突变体降低至58％，并针对两种蛋白质的表达水平进行了标准化。
由于具有胆固醇结合位点突变的HA被转运至质膜，但不再存在于富含胆固醇的域中（de Vries 等人，2015年），因此可以认为其在细胞内的标记减少是由于事实上，他们附近的光胆固醇较少。因此，我们还标记了免疫沉淀的HA，但是，这也表明光胆固醇的掺入减少了（相对于wt HA，减少了38％）。

牛逼卢布拍摄：

有效的交联需要大量的目标蛋白。因此，应将相应的基因克隆到具有强启动子的载体中，以实现高表达水平。
用于标记的光胆固醇的量可以变化。我们测试了20 μ 男，50 μM 和100 μM（最终浓度），用于与免疫沉淀HA标签。浓度越高，凝胶中的荧光信号越强。在最后的协议中，我们使用相同的终浓度50 μM用于标记HA两者在活细胞（5 μ 升photocholesterol 在1M 升DMEM）并用免疫沉淀蛋白（0.5 μ 升photocholesterol 在0.1M 升PBS）。
如果在标记活细胞后在目标蛋白中没有看到信号，则仍可以尝试标记免疫沉淀的蛋白，因为可以实现更高浓度的酚胆固醇，并且该化合物不会与膜中存在的真实胆固醇竞争。
如果分析的蛋白质不稳定，则可以省略用PBS洗涤的步骤（第I部分中的S tep D 9）。可以将4 x 还原负载缓冲液直接添加到样品中，煮沸并进行SDS- PAGE。在这种情况下，必须用ddH 2 O 过夜清洗凝胶，以洗去Picolyl-Azide-Sulfo-Cy3的背景信号。
如果不能重复得出阳性结果，请考虑使用新的CuAAC 试剂盒。

菜谱

生长培养基（储存在4°C）
记忆体

10％FCS

100 U / L青霉素/链霉素

IP缓冲区（在4°C下过滤并存储长达1年）
500 mM Tris-HCl（pH 7.4）

EDTA 20毫米

30 mM焦磷酸钠十水合物

10 mM氟化钠

1 mM原钒酸钠

2 mM苄am

1 mM PMSF（苯甲基磺酰氟）

1 mM NEM

1x蛋白酶抑制剂混合物（每个实验新添加）

注意：根据所研究的蛋白质，可以省略某些蛋白酶抑制剂。

裂解缓冲液（新鲜配制）
IP缓冲区中的1％NP40

堆积凝胶溶液（新鲜配制）
4％（w / v）丙烯酰胺/ 双丙烯酰胺

0.1％SDS

125 mM Tris - HCl（pH 6.8）

0.075％（w / v）APS

0.15％（v / v）适时

分离凝胶溶液（新鲜配制）
12％（w / v）丙烯酰胺/ 双丙烯酰胺储备溶液

0.1％（w / v）的SDS

375 mM Tris - HCl（pH 8.8）

0.05％（w / v）APS

0.1％（v / v）TEMED

5个非还原负载缓冲器（存储在-20 °C下）
1 M Tris - HCl

10％（w / v）SDS

50％（v / v）甘油

0.1％（w / v）溴酚蓝

pH值6.8

4倍减少负载缓冲液（存储在-20 °C时）
1 m l 5x非还原缓冲器

250 µl 2 M（20x）DTT

PBST（室温保存）
含0.1％Tween-20的PBS

封闭液（新鲜配制）
PBST中的3％脱脂牛奶

致谢

这项工作得到了德国研究基金会（SFB 740，TP C3）和人类前沿科学计划（授予MV）的支持。BH是博士学位的获得者。中国国家奖学金委员会（CSC）的研究金。CT由德国研究基金会根据德国卓越战略（EXC2151-390873048）资助。MRG获得博士学位。d 。来自DAAD的研究金。该协议改编自Hu 等人。（2019 ）。

利益争夺

BH和合著者声明没有利益冲突。

参考文献

de Vries，M.，Herrmann，A.和Veit ，M.（2015年）。胆固醇共有基序是有效的细胞内运输和流感病毒第2组HA的筏筏结合所必需的。生物化学Ĵ 465（2）：305-314。
Hu，B.，Höfer ，CT，Thiele，C.和Veit ，M.（2019）。胆固醇与流感病毒第2组血凝素（HA）的跨膜区结合对于病毒复制至关重要，既影响病毒装配又影响HA融合活性。J Virol 93（15）：e00555-00519。
Hulce ，JJ，Cognetta ，AB，Niphakis ，MJ，Tully，SE和Cravatt ，BF（2013）。哺乳动物细胞中与胆固醇相互作用的蛋白质的全蛋白质组定位。Nat Methods 10（3）：259-264。
Mintzer，EA，Waarts，BL，Wilschut，J。和Bittman，R。（2002）。在模型膜中胆固醇可光活化类似物6-光胆固醇的行为。FEBS Lett 510（3）：181-184。
Niwa ，H.，Yammura，K。和Miyazaki，J。（1991）。具有新型真核载体的高效表达转染子的高效选择。基因108（2）：193-199。
Thiele，C.，Hannah，MJ，Fahrenholz，F.和Huttner，WB（2000）。胆固醇与突触素结合，是突触小泡的生物发生所必需的。Nat Cell Biol 2（1）：42-49。