材料和试剂

DNA低结合力1.5 ml管（Eppendorf，目录号：0030108051）
锁相管（5Prime，货号：2302830）
Agencourt AMPure XP珠子（Beckmann Coultier ，目录号：A63381）
Protein G Dynabeads （Thermo Fisher Scientific，目录号：10003D）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A4737）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，目录号：E00491）
酵母tRNA（Sigma-Aldrich，目录号：R8759 ）
抗H3K27Me3抗体（Active Motif，目录号：39155）
抗H3抗体（Abcam，目录号：ab1791）
抗H3K4Me3抗体（Abcam，目录号：ab8580）
抗H3K9Me3抗体（Active Motif，目录号：39161）
胶原酶I（Sigma-Aldrich，目录号：1148089）
木瓜蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：1495005）
底漆（表1）

表1. 具有唯一条形码的引物列表

底漆

fw ATAC-seq底漆，常规，无索引

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGT * G

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，34 CATGGC

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCATGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，48 TCGGCA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，22 CGTACG

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

转ATAC-seq引物，Truseq 指数，15 ATGTCA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，46 TCCCGA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，45 TCATTC

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAATGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，40 CTCAGA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

转ATAC-seq引物，Truseq 指数，39 CTATAC

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，38 CTAGCT

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，37 CGGAAT

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTCCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

转ATAC-seq引物，Truseq 指数，36 CCAACA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，35 CATTTT

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAATGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，25 ACTGAT

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，26 ATGAGC

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，27 ATTCCT

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

修订版ATAC-seq引物，Truseq 指数，28 CAAAAG

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，23 GAGTGG

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，24 GGTAGC

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，42 TAATCG

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATG * T

rev ATAC-seq引物，Truseq 指数，41 GACGAC

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTCGTCTCGTGTGGGCTCGGAGATG * T

NEXTERA XT DNA文库制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-131-1024）
NEBNext 高保真2x PCR 预混液（New England Biolabs，目录号：M0541）
糖原（罗氏（Roche），货号：10901393001）
37％甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046 ）
蛋白酶抑制剂混合物（乙imake的，猫考勤号：B14001）
Tris Buffer pH 8.0（Applichem ，目录号：A4577）
EDTA（Sigma-Aldrich，EDS 目录号：EDS-500G ）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
20％十二烷基硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：05030）
核酸酶- ˚F REE 瓦特亚特（QIAGEN，目录号：129115）
三（羟甲基）氨基甲烷（Sigma-Aldrich，目录号：252859 ）
N，N- - 二甲基甲酰胺（Sigma-Aldrich公司，目录号：D4551）
Qubit dsDNA高灵敏度试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q33230）
用于生物分析仪的DNA高灵敏度试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4627）
施耐德的介质（Thermo Fisher Scientific ，目录号21720-001）
苯酚：氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：P3803 ）
3 M乙酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9740 ）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：51976 ）
赫斯特染色（Thermo Fisher Scientific，目录号：62249）
MgCl 2 （Sig ma-Aldrich，目录号：63068 ）
解离解决方案（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见配方）
RIPA（140 mM）（请参阅食谱）
RIPA（250 mM）（请参阅食谱）
TE缓冲液（请参阅配方）
标记缓冲液（自制）（请参见食谱）

设备

DiaMag 0.2 ml磁力架（Diagenode ，目录号：B04000001）
DynaMag-2磁架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
Bioruptor plus（Diagenode ，目录号：B01020001）
紧凑型Thermomix（Eppendorf，目录号：T1317）
Bio-Rad PCR循环仪（Bio-Rad，目录号：C1000）
微型管旋转器（Biotools ，AG，R2001）
台式微型离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75002478）
安捷伦生物分析仪2100（安捷伦，目录号：G2939BA）
Qubit荧光计3（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q33216）
流式细胞仪（BD FACS Aria）

软件

MACS2（版本2.1.1.20160309，https://github.com/taoliu/MACS）
Deeptools（版本3.1.3，https://github.com/deeptools/deepTools）
Samtools（版本1.09，https://github.com/samtools/samtools）
bowtie2（版本2.3.5，https://github.com/BenLangmead/bowtie2）
FastQC （版本0.10.1，https://github.com/s-andrews/FastQC）

程序

细胞固定和小号奥廷（人类细胞）
将细胞收集在1.5 ml Eppendorf管中，并重悬于PBS中。
在室温下用1％甲醛（在PBS中）固定细胞10分钟。
用125 mM甘氨酸淬灭交联键，并在室温下孵育5分钟。
用Hoechst染色剂染色细胞，并使用流式细胞仪将100个细胞分类为200个 μ升的140mM的RIPA缓冲液（配方3）。
注意：由于小体积，对少量单元格进行排序不会对缓冲液成分产生影响。

细胞我溶胶化，固定和š 奥廷（果蝇神经母细胞）
在PBS中解剖所需数量的幼虫大脑（例如：在其内源性增强子的控制下表达GFP标记的无活性（Dpn ）蛋白的转基因果蝇）。
用PBS洗涤一次，并在室温下用1％甲醛（在PBT中）固定大脑10分钟。
用125 mM甘氨酸淬灭交联键，并在室温下孵育5分钟。
重新移动至骤冷溶液，并用PBS洗两次。
解离溶液（配方1）添加到脑组织和离开它在30 1个小时 ℃下用恒定在650rpm下振荡培养。每隔15分钟向上或向下吹动一次，以搅动大脑。
通过以100 xg 离心将细胞沉淀，然后重悬于PBS中。
排序细胞上GFP通道下的流式细胞仪，并直接排序1 ，000细胞进入200 μ 升的140mM的RIPA缓冲液。
注意：由于小体积，对少量单元格进行排序不会对缓冲液成分产生影响。

免疫沉淀
绑定1 μ 克抗体至15中的μ 升G蛋白的磁珠在200 μ 升封闭缓冲液（配方2）。
在4 °C 孵育2-3小时。
在Bio ruptor 超声仪中，在低功率设置下，“打开” / “关闭” 30秒，将RIPA中收集的细胞的细胞核破碎3个循环。
将试管放在DynaMag-2磁力架上，除去封闭缓冲液，然后添加步骤C1中的裂解物。
头朝尾旋转，在4 °C下孵育过夜。
与磁性架分离珠和用300洗两次μ 升自制的tagmentation 通过再悬浮与1000珠缓冲液（配方6）μ 升移液管。在微量离心机上脉冲旋转离心管，然后用DynaMag-2磁力架再次分离，在不干扰磁珠的情况下尽可能多地除去缓冲液。

标记，反向交联和苯酚：氯仿萃取
重悬20珠粒μ 升1X的tagmentation 缓冲器含有1 μ 升Tn5转座酶（来自NEXTERA XT DNA文库制备试剂盒）。
将重悬的磁珠在热块中于37 °C 孵育40分钟，并以500 rpm的速度恒定摇动。
除去tagmentation 通过分离珠缓冲器上DynaMag-2磁架一第二洗珠如下：
一次使用140 mM RIPA ;
˚F 我们时代用250mM RIPA（配方4）;
Ť WICE用TE缓冲液（配方5）。
注意：EAC ħ洗涤应该是3分钟，并用200 μ 升洗涤缓冲液中。所有洗涤均应在4 °C的冷藏室中进行。

在重悬在100洗涤的珠μ 升TE缓冲液中，并加入5 μ 升20毫克/毫升蛋白酶K孵育在60珠子至少6小时℃的热块中在500rpm摇动。
添加100 μ 升TE缓冲液中，接着300 μ 升的苯酚：氯仿。短暂涡旋试管，然后将内含物转移至锁相管（以14,000 rpm预纺30 s）。在室温下，将试管以20,000 xg离心5分钟。
上层水相转移到新鲜DNA低绑定管中，加入5 μ 升20毫克/毫升糖原和20的μ 升的的确切顺序3M乙酸钠（pH 5.2），涡流简要。加入700 μ 升的无水乙醇和涡简要介绍。在-80 °C下孵育过夜以沉淀。
将试管在4 °C下以全速（20,000 xg ）离心30-45分钟。通过以20,000离心洗涤沉淀一次用75％乙醇X 克在4℃下10分钟，并重新悬浮在30颗粒μ 升TE缓冲液。

PCR扩增和纯化
按照以下反应混合物设置PCR反应。
正向引物（通用）20 μ 中号：2 μ 升

反向引物（具有索引）20 μ 中号：2 μ 升

反向的交联材料：30 μ 升

不含核酸酶的水：16 μ 升

2X NEBNext 高保真PCR混合物：50 μ 升

根据以下循环参数，在加热盖设为105 °C 的热循环仪中运行PCR反应：
72°C 3分钟

{98°C持续10 s

63°C持续30 s

72°C 30 s}，12个循环

72°C 5分钟

保持在4℃。

同时，在进行PCR反应时，将Ampure XP珠子从4 °C 移至室温。使用前，应将Ampure 珠子在室温下放置至少30分钟以使其平衡。
将0.2x体积（相对于PCR反应体积）的Ampure XP微珠添加到PCR反应中，并在室温下孵育5分钟。在DiaMag 0.2 ml磁力架上分离珠子，小心转移溶液，不要将珠子移到新的PCR管中。丢弃Ampure XP珠子。
向溶液中加入0.8x 体积的Ampure XP（相对于PCR反应体积）珠子，并在室温下孵育5分钟。将珠子在DiaMag 0.2 ml磁力架上分开，小心丢弃溶液，不要打扰珠子。
用洗涤珠两次200 μ 升新鲜制备的80％乙醇，在不干扰珠子。
干燥小珠，直到小珠表面的外观从光泽变为无光泽。
洗脱成品库10-15 μ 升的无核酸酶的水。

图书馆的质量控制
按照制造商的规程，使用Qubit dsDNA高灵敏度试剂盒测量文库的浓度。
使用Agilent Bioanalyzer在DNA高灵敏度芯片上运行文库，以检查DNA片段的大小分布。按照DNA高灵敏度试剂盒随附的规程装载和运行样品。
确定文库的摩尔浓度，并按照测序设备的要求将其稀释至10 nM 浓度。
注意：文库的浓度和文库的平均大小片段（如Bioanalyzer所示）用于计算摩尔浓度。用来计算浓度的公式是，浓度在纳米=（以ng /浓度μ 升从量子比特测量）/（660克库/摩尔X平均大小）×10 6 。

数据一nalysis

序列质量检查
使用FastQC 通过fastqc 文件评估测序质量。或者，也可以使用其他等效的QC工具，例如MAPQC。

使用Bowtie2生成参考基因组的索引（从Ensemble数据库下载fasta 文件）
bowtie2-build -f $ FASTA_PATH / 基因组.fa $ INDEX_PATH / bowtie2_index

使用bowtie2 （Langmead，20 10 ）将读取结果映射到dm6或hg38程序集
bowtie2 -x $ INDEX_PATH / genome -p 24 -1 $ SEQ_PATH / * file_1 * .gz -2 $ SEQ_PATH / * file_2 * .gz | samtools 查看- 将bS > file.bam

排序映射读
Samtools 排序file.bam > file.sorted.bam

索引bam文件
Samtools 索引file.bam file.bam.bai

使用DeepTools 生成coverage文件（Ramirez 等，20 16 ）
bamCoverage –b file.bam –规范化使用RPKM -bs 50 – smoothLength 175 -o file.bw

生成coverage文件后的代表性跟踪示例如图1所示。

使用MACS2和H3作为控制的峰值调用（Zhang 等，20 08 ）
Macs2 callpeak -t $ File -c $ File -f BAMPE-g d – outdir –name

Macs2 callpeak -t $ File -c $ File -f BAMPE-g hs – outdir – 名称

使用DeepTools的热图
C omputeMatrix 标度区域– S file.bw- Rgenes.bed –b 600 –a 600 -o matrix.mat.gz

plotHeatmap -m matrix.mat.gz -out Heatmap.pdf

流程图显示了协议中的主要步骤，如图1所示。生成覆盖文件后的代表性跟踪示例如图2所示。使用100个小区和最近发布的CUT＆RUN数据集进行的TAF- ChIP 方法的比较，连同ENCODE数据集，如图3所示。

图1的步骤中涉及的Tagmentati 上辅助碎片（TAF）- 的ChIP 协议和随后的数据处理。TAF- ChIP 工作流程中涉及的步骤按时间顺序表示为流程图。

图2.通过TAF- ChIP 方法和常规ChIP - Seq 方法生成的H3K4Me3的基因组浏览器跟踪示例。的基因组浏览器轨道的ChIP 在1中执行，000 FACS分选的果蝇神经干细胞（NSCs）与TAF- 的ChIP 方法（TAF_K4Me3）和相应的传统的ChIP -Seq数据集从120万个FACS分选的与独立的生物重复的NSCs（Conv_K4Me3）。轨道下方的标签显示了基因模型，y轴表示标准化的读取密度（百万分之一读取）。

图3. TAF- ChIP 与常规ChIP- Seq以及另一种现代少量方法的比较。A. 使用ROC曲线比较K562细胞中H3K27Me3的TAF- ChIP 和CUT＆RUN。使用常规ChIP -Seq ENCODE数据集作为参考，以FDR截止值为5％生成图。TAF- ChIP 复制和CUT＆RUN数据集的峰是使用无FDR阈值的MACS2生成的。将峰映射到5 kb非重叠基因组窗口，以计算变化的P值阈值的真阳性率，假阳性率和精度。图例中显示了曲线下的面积（AUC），*表示无法计算AUC。B. K56 2细胞中H3K27Me3的TAF - ChIP 和CUT＆RUN数据集的精确调用曲线。该图改编自Akhtar 等人。（2019）。

菜谱

解离溶液
施耐德的媒介

1 mg / ml胶原酶I

1毫克/毫升木瓜蛋白酶

阻塞缓冲
10毫米Tris-Cl pH 8.0

140毫米氯化钠

0.5 mM EDTA pH 8.0

1％的Triton X-100

0.1％SDS

0.2 mg / ml牛血清白蛋白

0.05 mg / ml糖原

0.2 mg / ml酵母tRNA

RIPA（140毫米）
10毫米Tris-Cl pH 8.0

140毫米氯化钠

0.5 mM EDTA pH 8.0

1％的Triton X-100

0.1％SDS

RIPA（250毫米）
10毫米Tris-Cl pH 8.0

140毫米氯化钠

0.5 mM EDTA pH 8.0

1％的Triton X-100

0.1％SDS

TE缓冲液
10毫米Tris-Cl pH 8.0

0.5 mM EDTA pH 8.0

标记缓冲液（自制）
20 mM三（羟甲基）氨基甲烷pH 7.6

10毫米MgCl 2

20％（体积/体积）二甲基甲酰胺

致谢

这项工作得到了德国联邦储蓄基金会（DFG）授予DFG BE 4728 1-1和3-1的支持。美因茨分子生物学研究所的国际博士学位计划（IPP）支持SA的博士学位工作。和PM 。我们还要感谢IMB FACS核心设施为我们的分类提供了帮助。

这项工作是我们之前发表的工作的详细改编版本（Akhtar 等，2019）。FACS分拣工作流程是根据早期工作改编和修改的（Berger 等，2012 ）。

利益争夺

作者声明没有任何金融和非金融竞争利益。

伦理

在果蝇中描述的实验是根据指导原则进行的（无脊椎动物不在德国的动物福利/道德法律范围内）。这些实验均未在人类受试者上进行。

参考文献

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Berger，C.，Harzer ，H.，Burkard，TR，Steinmann，J.，van der Horst，S.，Laurenson ，AS，Novatchkova M.，Reichert，H.和Knoblich ，JA（2012）。FACS净化和转录组分析d rosophila 神经干细胞揭示了Klumpfuss在自我更新的作用。Cell Rep 2（2）：407-418。
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