材料和试剂

1.5 m l E 悬臂式F 刻度管（Fisher，目录号：05-408-137）
15 ml锥形管（Thermo Fisher，目录号：339651）
50 ml锥形管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339652）
60 ml一次性注射器
乙烯基试样模（组织Tek公司Cryomold ，目录号：4566）
圆底聚苯乙烯管（“ FACS管”）（Falcon，目录号：352052）
注射器驱动过滤器（0.45 μ米）（Millipore公司，目录号：SLHP033RS）
陪替氏培养皿100 毫米X 20 毫米（费舍尔，目录号：FB0875711Z）
聚碳酸酯厚壁超速离心管（贝克曼库尔特，目录号：355631）
细胞过滤器（70 μ 米）（费舍尔，目录号：22363548）
Mega Cassette System Tissue Tek（樱花，货号：4173）
96个V型底部培养板（Corning，目录号：3894）
96孔白色组织培养物处理的无菌微孔板（PerkinElmer，目录号：6005680）
T175培养瓶（Celltreat ，目录号：229351）
TZM-bl细胞（艾滋病试剂计划，目录号：8129）
TF传染性分子克隆：
CH040（艾滋病试剂计划，目录号：11740）
CH058（艾滋病试剂计划，目录号：11856）
CH077（艾滋病试剂计划，目录号：11742）
CH470（艾滋病试剂计划，目录号：12422）
APC抗人类CD8（克隆RPA-T8）（Tonbo Biosciences，目录号：20-0088）
牛血清白蛋白（BSA）（Fisher Scientific，目录号：BP1600-100）
293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
RD-1 HIV-1核心抗原（克隆KC57）（Beckman Coulter，目录号：6604667）
0.25％胰蛋白酶（Corning，目录号：MT25053Cl）
胶原酶D（Roche Diagnostics，目录号11088882001）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25-1G）
胎牛血清（FBS）（生命技术，目录号：26140079）
HIV p24抗原ELISA（Perkin Elmer，目录号：NEK05001KT）
人源AB血清（Gemini Bioproducts ，目录号：100-512）
One Shot TM Stbl3感受态细胞（ThermoFisher ，目录号：C737303）
PE / Dazzle 594抗人类CD3（克隆UCHT1）（Biolegend ，目录号：300450）
2 M CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
10％磷酸福尔马林缓冲液（Fisher Scientific，目录号：SF100-4）
PBS中20％蔗糖溶液
70％EtOH由在分子生物学级水（Hyclone ，目录号：SH30538.03）中稀释的绝对EtOH200标准（Fisher Scientific，目录号：BP2818-4）组成。
氨苄西林钠盐（Fisher Scientific，目录号：BP1760-5）
Britelite TM plus试剂（PerkinElmer，目录号：6066671）
冷冻管瓶（Thermo Scientific，目录号：363401）
硫酸葡聚糖（Fisher Scientific，目录号BP1585-100）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：D2650-5X10mL）
DL-二硫苏糖醇（D TT）（Sigma，目录号：D9779-1G）
Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）（Corning，目录号：MT10013CV。
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GIBCO，目录号：14190-144）
EDTA（Sigma -Aldrich ，目录号：E6511-100G）
真菌区（两性霉素B）（Corning，目录号：30-003-CF）
汉克斯平衡盐溶液1x （HBSS）（Corning，目录号：21-021-CM）
HEPES（Sigma -Aldrich ，目录号：H0887-100mL）
硫酸卡那霉素（Fisher Scientific，目录号：BP906-5）
LB肉汤（科学的F isher，目录号：BP9723）
介质A（固定介质）（贝克曼库尔特，目录号：GAS001S100）
培养基B（通透缓冲液）（Beckman Coulter，目录号：GAS002S100）
多聚甲醛（Fisher Scientific，目录号：T353-500）
青霉素和链霉素和L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：10378-016）
青霉素-链霉素（Corning，目录号：30-002-Cl）
Qiagen HiSpeed Plasmid Maxi Kit（Qiagen ，目录号：12662）
OTC化合物（组织卫生纸，目录号：4583）
RNA Later Solution（Invitrogen，目录号：AM7021）
RPMI 1640（RPMI）（Gibco ，目录号：11875-093）
SOC介质（Corning，目录号：46-003-CR）
台盼蓝（Corning，目录号：25-900-CI）
Zombie Aqua Fixable活力染料（Biolegend ，目录号：423102）
佐辛（哌拉西林/ 他唑菌）（Novaplus ，目录号：44567-801-10）
ķ 氯
氯化钠
Na 2 PO 4 · 7H 2 O
葡萄糖
1％多聚甲醛（请参阅食谱）
解冻介质（请参阅食谱）
2个HBS缓冲区（请参阅配方）
完整的DMEM介质（请参阅食谱）
文化RPMI媒体（请参阅食谱）
流染色缓冲液（请参见配方）
隔夜保存空肠组织的介质（请参阅食谱）
粘液清除介质（请参阅食谱）
上皮去除介质（请参阅食谱）
用于LPMC分离的胶原酶培养基（请参见食谱）
隔离的LPMC的防腐剂（请参见食谱）
用于TF病毒浓缩的完整RPMI培养基（请参阅食谱）
缺乏BSA的改良上皮去除培养基（请参阅食谱）

设备

37 °C 水浴
37 °C 保温箱
CENTRI 夫格（Beckman Coulter公司，米Odel等：Allegra6R）
Cool Cell LX冷冻容器（生物切割，目录号：BCS-405）
Germinator 500（手术设备消毒器）（Cell Point Scientific Inc.，目录号：11931）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号1492）
照度计板读取器（PerkinElm er 2030 Multlabel 读取器，型号：Victor TM X5）
多通道移液器（Ranin 20 - 200 μ 升LTS，型号：LM12-200）
多色流式细胞仪（BD Biosciences，LSRII）
混合搅拌器定速120V（转子）（Fisher Scientific，目录号：88-861-041）
轨道振动筛（Forma Scientific，型号：4518）
TC20自动细胞计数仪（Bio-Rad，目录号：1450102 ）
Stratacooler （Stratagene Agilent，目录号：401349）
Surgic al钳（VWR，目录号：82027-388）
手术剪（VWR，货号：82027-590）

软件

的FlowJo 软件（树星公司。）

程序

从人空肠分离LPMC
从大学获得空肠组织的科罗拉多州医院择期腹部手术的患者。提供空肠组织的手术类型包括Whipple手术和肠梗阻。接受的空肠组织代表手术切缘（否则将被丢弃的组织），并且在肉眼上是正常的（通过组织学的病理评估证实）。外科医生切除空肠组织与实验室人员收集空肠组织之间的时间间隔为30分钟至3小时。以下方案详细说明了如何从整个空肠组织中分离LPMC，但简单来说，是从医院获得组织样品，取出小块进行组织学或RNA 保留，其余组织在隔夜培养基中保存过夜，第二天解剖组织以分离粘膜层，然后进行机械和酶消化以分离用于低温保存的LPMC。

从医院获取组织。通常，将其提供在标本容器中（取决于组织尺寸）。
放置整个组织中P ETRI皿中并称重; 记录体重。
使用外科镊子和剪刀，切断3个小块组织的（0.5 厘米2 各自），使得确保包括黏膜层和任何下面的组织。
注意：通常，组织为长管，两端缝合有外科缝合线。您可能需要一端切除外科缝合线才能进入内部粘膜。

将1个组织片放入装有1 ml RNA的1.5 ml Eppendorf管中。将试管保存在-20 °C下，直到用于整个组织的基因分析（例如，细菌门的ccr5 或与粘膜相关的16S的表达）。
将1个组织块放入装有1 ml 10％福尔马林缓冲液的1.5 ml Eppendorf管中。将试管在室温下保存24小时。24小时后，取出组织并转移到新的Eppendorf管中，该管中含有1 ml 70％的EtOH。储存在室温下，直到石蜡包埋后用于整个组织的组织学分析。
将1张纸巾放入装有OTC的乙烯基样品模具中。用更多的OTC覆盖组织表面，然后将标本模具放入大型盒中。将整个盒带放入液氮中5分钟，以使组织快速冻结。将盒转移到-80 °C进行储存，直到用于整个组织的组织学分析。
用5 ml RT HBSS 冲洗剩余的组织。重复冲洗2-3次，直到组织干净为止（即，血液不再可见，并且通过去除缝合线打开组织一端而露出的任何粪便都被洗掉了）。
将组织放回标本容器中，并添加足够的过夜培养基（方案1）以覆盖整个组织（约10-30 ml）。
在4 ° C下储存过夜。
第二天早晨，整个组织转移到P ETRI菜FO ř清扫。
使用手术钳和剪刀，切断所有手术缝线，以使组织“管”的两端都穿过。
沿组织“管” 的较长长度切开一个切口。
躺在全开组织片P 与粘膜面朝下，肌肉/脂肪侧朝上（图2A）ETRI菜。
注意：脂肪通常为淡黄色/白色，并附着在肌肉上。肌肉层坚硬，呈粉红色/红色。经常可以看到大块的肌肉。粘膜层柔软而浅棕色。

从一端开始，使用镊子将肌肉层从粘膜上拉开，然后向下切割以从粘膜上去除肌肉和脂肪，并在进行过程中将各层分开。可以将组织倒置以更容易进入粘膜（图2B）。去除所有肌肉和脂肪后，可见平滑而独特的粘膜层和接连的肌肉/脂肪层（图2C）。
粘膜层转移到一个P ETRI皿中并称重; 记录“仅粘膜”重量。
将粘膜切成小块，重约1 g。将每个粘膜片到它自己的50 ml的共nical管（例如，5 克粘膜因此需要五个50ml锥形管）。
向每个试管中加入30 ml粘液去除介质（配方2）。
将试管放到位于37 °C恒温箱内的旋转器上，并在盖紧后旋转45 分钟。
使用带刻度的移液管从每个试管中清除液体，然后直接丢弃成废液。
向每个试管中加入20 ml RT HBSS，并涡旋10秒钟，以洗去组织上任何残留的粘液。使用带刻度的移液管从每个试管中除去洗涤液，然后直接丢弃到废液中。
重复清洗2-3次，直到液体澄清并清除了粘液。
将组织块转移到新的50 ml 锥形管中。
向每个管中添加30 ml ep 氦气去除介质（配方3）。
将试管放到位于37 °C恒温箱内的旋转器上，并在盖紧后旋转45 分钟。
使用带刻度的移液管从每个试管中清除液体，然后直接丢弃成废液。现在，组织将显示为浅粉红色（图2D）。

˚F igure 2. 组织剥离和LPMC隔离图像。A. 组织被放置在一个P 与粘膜面朝下ETRI菜。肌肉层和脂肪层都朝上。B. 组织方向反转，肌肉/脂肪层朝下，粘膜层朝上。镊子将粘膜层（浅棕色）固定住，并用剪刀将其从肌肉/脂肪层上拉开。C. 解剖完成后对两个分开的层的描绘。D. 在与EDTA一起孵育期间上皮去除后的组织。粘膜颜色为浅粉红色。E. 组织糜来准备用于治疗用胶原酶吨ö酶促除去LPMCs。F. 在胶原酶中孵育后的组织片段和细胞。（图片由Kaylee Mickens提供。）

向每个试管中加入20 ml RT HBSS，并牢固涡旋10 s，以进一步清除所有疏松的上皮细胞。使用带刻度的移液管从每个试管中清除液体，然后直接丢弃成废液。重复2-3次，直到液体澄清且没有更多的上皮细胞脱离。
加入30 ml的EP ithelium去除米EDIA（配方3）向含有1管克片粘膜。
将试管放到位于37 °C恒温箱内的旋转器上，并在紧紧盖紧的情况下旋转45 分钟进行第二次保温。
重复小号TEPS 18-19以除去上皮细胞层。
注意：如果下游对LPMC的检查表明上皮细胞没有被充分去除（例如，通过显微镜检测到的上皮细胞的存在或通过流式细胞仪染色后大多数细胞的CD45阴性），则建议采取额外的步骤。

附加步骤：在存在30 ml 不含BS A 的改良上皮去除培养基的情况下，将装有1 g粘膜的试管连续涡旋5分钟（配方13）。如上所述除去液体，并根据需要用新鲜培养基重复涡旋1-3x。

从1管和转印除去粘膜组织到P ETRI菜。使用手术钳和剪刀将组织切成小块（图2E）。将切碎的组织转移到新的50 ml锥形管中。重复所有具有粘膜组织的试管，以准备组织进行酶消化。
向每支试管中加入20 ml胶原酶，用于LPMC分离（配方4 ）。
将试管放在37 °C恒温箱内的旋转器上，并在盖紧后旋转60 分钟。现在，组织碎片的颜色为白色（图2F）。
使用带刻度的移液器从每个试管中除去液体，并通过放置在新的50 ml 锥形收集管内的加速滤网（70μm ）过滤液体（该液体将包含LPMC）。
向每个试管中加入20 ml RT HBSS，并轻轻涡旋5秒钟，以进一步清除所有松散的LPMC。
使用带刻度的移液器从每个试管中除去液体，并通过置于50 ml 锥形收集管内的加速滤网（70μm ）过滤。
重复2-3次，直到澄清液体并且不再有LPMC脱离。
为50 ml的已经用于收集LPMCs，锥形管PE llet 通过离心细胞（585 ×g下，8分钟，一吨25 ℃;破设置为“高” ）。
加入1 ml 培养基以重悬每个LPMC沉淀（R ecipe 7），并将细胞沉淀合并到1个试管中。储存在4 °C直至冻结细胞。
向每支试管中加入20 ml 胶原酶，用于LPMC分离（配方4 ）。
将试管放在37 °C恒温箱内的旋转器上，并在紧紧盖紧盖子的情况下再旋转60 分钟。
重复小号TEPS 一26- 一27，以收集更多LPMCs。
使用适当的生物废物处理方法丢弃所有剩余的组织。这些组织碎片将为白色，呈纤维状，表明空肠组织已完全消化。
在装有收集的LPMC的试管中，使用HBSS将体积提高至25 ml。确保细胞完全悬浮并在液体中均匀，否则会影响细胞计数。
删除15 微升细胞悬液，并加入到15 微升0.4％台盼蓝。
加载10μl 细胞混合物，并使用血细胞计数器计数LPMC。
计算从组织处理中回收的LPMC总数。
LPMC的冷冻量应为每个冷冻管5至1000万个细胞，因此应标明在冷冻管之间分配总LPMC所需的适当数目的冷冻管。
在冷的StrataCooler 中预冷标记的冷冻管。
P Ë llet 细胞通过离心（585 ×g下，8分钟，在25 ℃;破设置为“高” ）。
使用带有刻度的移液管从试管中除去液体，并直接丢弃到废液中。
到的LPMC细胞沉淀，加入500 微升每离心管培养RPMI培养基的（配方7）。确保细胞完全悬浮并在液体中均匀，否则细胞在冷冻管中的分布会不均匀。
注意：如果总LPMCs将被分割为4个冷冻管，然后加入500 微升×4 = 2 ，000 微升培养RPMI培养基中，以细胞沉淀。

SL owly加入500 微升每离心管（在体积加入等于先前的总量防腐剂（配方的步骤）5 ）。轻轻旋转混合。
注意：如果总LPMCs将被分成4个冷冻管中，然后加入500 微升×4 = 2 ，000 微升防腐剂以细胞沉淀。

将1 ml LPMC转移到每个冷冻管。（实施例在先前步骤中使用的：管现在包含LPMCs 重悬浮在4 ，000 微升由2 ，000 微升培养RPMI培养基+ 2 ，000 微升防腐剂，共4 ml至之中4个冷冻管被划分。）
将包含LPMC的冷冻管转移到Cool Cell冷冻容器中。
将冷冻容器在-80 °C下放置24小时。
将冷冻保存的LPMC转移到液氮中以备使用。

冻存的LPMC解冻
地方解冻介质（配方6）在一个37 °C水浴至少30分钟。
加入100 微升解冻媒体到一个15ml锥形管中。每1个LPMC冷冻管1 x 15 ml锥形瓶（冷冻保存5-10 x 10 6个细胞/小瓶）。
在冰冻的LPMC冻存管放置在37 ℃的快速水浴解冻。
转印解冻LPMC入一个15ml锥形含有100 μ 升解冻介质（步骤A2）。
等待1 分钟。
加入200 μ 升解冻媒体到15ml锥形管中，等待1 分钟。
添加400 μ 升解冻媒体到15ml锥形管中，等待1 分钟。
添加800 μ 升解冻媒体到15ml锥形管中，等待1 分钟。
将1.6 ml解冻介质添加到15 ml锥形管中，等待1 分钟。
将3.2 ml解冻介质添加到15 ml锥形管中，等待1 分钟。
添加额外的解冻介质，最终体积为10 ml。
通过在25 °C （RT；间隔设为“高” ）离心（585 xg ，8分钟）沉淀细胞。
移出上清液并轻拂试管以移出沉淀。
将LPMC重悬于1 ml解冻介质中，并轻轻上下移液，添加9 ml解冻介质。
通过离心（585 xg ，在25 °C下运行8分钟；在25 ℃下设置为“高” ）沉淀细胞。
移出上清液并轻拂试管以移出沉淀。
重悬LPMC在1ml DPBS RT，并通过过滤器的细胞过滤器（70 μ 米）。
过滤LPMC的提示：

用DPBS预湿过滤器。
加入LPMC / DPBS。
用DPBS冲洗15 ml锥形瓶并过滤。
直接添加1 ml DPBS过滤以冲洗。
使用血球计数器计数台盼蓝中的LPMC。
通过在25 °C （RT；间隔设为“高” ）离心（585 xg ，8分钟）沉淀细胞。
移出上清液并轻拂试管以移出沉淀。
以2.5 x 10 6 LPMC / ml将LPMC 重悬于培养基（配方7）中。

感染p rotocol
该方案既利用了实验室适应性的R5嗜性HIV-1 Ba-L （Steele 等人，2014; Dillon 等人，2016），又利用了HIV-1传播/奠基人（TF）分子克隆（IMC ）CH058，CH470和CH040（哈珀等人，2015;约德。等人，2017）（见步骤小号E和F）。

将LPMC分成15 ml / s的锥形管，用于“模拟”和“ HIV”条件，并根据以下“ 自旋接种”标准（每2.5 x 10 6 LPMC中的HIV p24，以1 ml的最终体积注射）文化传媒）：
每毫升2.5 x 10 6 LPM C每毫升500 ng HIV p24抗原（p24）或每毫升2.5 x 10 6 LPM C 25 ng p24 HIV-1 Ba-L ，每15毫升锥形管不超过2.5 x 10 6 LPMC（即1毫升）。需要按照制造商的规程，使用HIV p24抗原ELISA对每种病毒制剂计算出HIV p24病毒原种的浓度。
如果需要多个15 ml锥形管，则将LPMC均匀地分布在各管上：例如，如果需要6 x 10 6 总LPMC 进行感染，则每15 ml试管分配2 x 10 6个细胞。
每15 ml锥形杯中具有匹配的LPMC / ml的模拟感染。
注意：如果使用表达GFP的病毒株，则在使用多色流评估表达GFP的LP CD4 T细胞时，将1.5 x 10 6 LPMC加入15 ml锥形瓶中，用作GFP补偿对照。

通过在25°C（RT；间隔设置为“高”）下离心（585 x g ，8分钟）沉淀细胞。
移走所有上清液并轻弹试管以去除沉淀。
在培养基中重悬LPMC，然后按计算添加HI V或模拟物（步骤B 1a）。下面是一个示例计算的详细信息（表1）。
表1说明了在总共1 ml的培养基中感染500 ng p24的2.5 x 10 6 LPMC 的计算方法。详细的列标题（表示为AE）已详细说明以帮助进行计算。
例如：

根据每2.5 x 10 6 LPMC 用500 ng p24 感染LPMC时每15 毫升试管中的细胞数（列A），计算所需的p24总量（列B）。每次接种的总最终体积基于每15 毫升试管感染不超过2.5 x 10 6 LPMC / ml 并在C列中计算。添加的病毒储备总量基于每支500 ng HIV p24的最终量2.5 x 10 6 LPMC，因此取决于库存HIV的p24浓度。本实例详述计算当股票浓度为20,000纳克的p24 / ml和基于列B VALU E（即，需要的总的p24）和C列（即，总终体积spinoculation ）。在V 培养基要添加olume是基于所述总体积（C栏）和V之间的差值加入olume的p24（柱d）。模拟物的体积与添加到HIV管中的p24 的体积相匹配。

表1.使用浓度为每毫升20,000 ng p24 的HIV病毒株的计算示例

一种

乙

C

d

Ë

每15 ml锥形管LPMC（x 10 6 ）

总计p24（A栏/2.5 x 500）

总体积
（A栏/2.5*1000 微升）

HIV /模拟量
（B栏/ 20,000 x C栏）

培养基体积
（C栏至E栏）

艾滋病毒

2.5

500 ng

1000 微升

25 微升

975 微升

嘲笑

2.5

“ 500 ng”

1000 微升

25 微升

975 微升

在室温下于1200 x g 离心2小时（RT；中断设置为“ off”）。
丢弃含有游离病毒的上清液，并重悬于1 ml培养基中。模拟管通过去除上清液和添加培养基进行类似处理。
在585 x g的条件下，在25°C下离心8分钟（室温；将中断设置为“高”）。
重悬于培养基中，终浓度为1 x 10 6 细胞/ ml。如果需要其他刺激条件，请将细胞分成15 ml锥形管，并适当添加刺激。
板LPMC到96 V形底培养板（200 μ 升每孔）。
加入200个μ 升DPBS周围井，以尽量减少文化传媒的蒸发。
在37°C，5％CO 2 和95％湿度下孵育4天。

多色流式细胞术方案，以确定HIV感染的LP CD4 T细胞的百分比
离心收集培养的LPMC和沉淀细胞（585 xg ，8分钟，室温；间隔设为“高”）。
将LPMC重悬于DPBS中，并使用自动细胞计数器以台盼蓝计数。记录所有条件下可行的LPMC数量。
准备一个抗体混合物，其中包含活性染料（每1 x 10 6 LPMC 1μl ）和针对CD3和CD8的荧光染料标签引导的抗体i 流染色缓冲液（配方8）（4°C）。fluorochrom的浓度Ë -label ED 抗体应该被滴定用于通过可流式细胞仪的最佳性能。
HIV下调CD4 表达，因此在体外感染HIV-1 后，LP CD4 T细胞被鉴定为CD3 + CD8 - T细胞（图2）。
适用于多色流式细胞术的特定活力染料和荧光染料标记的CD3和CD8抗体可以是用户特定的，并针对可用的流式细胞仪进行了优化。所示（图3）的例子使用僵尸水族可定影生存力染料（1 微升每1×10 6 LPMC），PE /达茨勒594抗人CD3（0.125 μ 克每1×10 6 LPMC）和APC抗人CD8（ 0.125 μ 克每1 X 10 6 LPMC）和上获得一个LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）中。
通过离心（585 x g ，5分钟，4°C；将断裂点设置为“高”）将LPMC转移到FACS管和沉淀细胞中。
移出上清液并轻拂试管以移出沉淀。
将LPMC重悬于抗体混合物中。
在4 °C下于黑暗中孵育30分钟。
加入4 ml DPBS（4 °C）并通过离心（585 x g ，5分钟，4°C；沉淀设定为“高”）沉淀细胞。
移出上清液并轻拂试管以移出沉淀。
重悬在LPMC 100 μ 升培养基甲（定影介质）。
在黑暗中孵育4 分钟，20分钟。
加入4 ml流式细胞仪缓冲液（4 °C）并通过离心（585 x g ，5分钟，4 °C；设定为“高”）破碎颗粒细胞。
移出上清液并轻拂试管以移出沉淀。
重悬在LPMC 100 μ 升培养基B（透含有5缓冲液）μ 升RD-1 HIV-1核心抗原。
在4 °C下于黑暗中孵育30分钟。
加入4 ml流式细胞仪缓冲液（4°C），并通过离心（585 x g ，5分钟，4°C；设置为“高”）沉淀细胞。
移出上清液并轻拂试管以移出沉淀。
重悬在LPMC 400 μ 升1％多聚甲醛（配方9）。
在4小时内在流式细胞仪上采集。

图3.使用多色流式细胞仪鉴定生产性感染的LP CD4 T细胞。A. CD3 + CD8 - LP CD4 T细胞的鉴定。如图所示，根据前向侧向散射区与侧向向散射区的特性，将活细胞鉴定为活力染料，然后在该群体中鉴定淋巴细胞。根据前向散布宽度与前向散布高度属性以及在这些单个单元格中标识的CD3 + CD8 - T单元，排除了双峰。B. 使用模拟条件作为对照，p24在CD3 + CD8 - LP CD4 T细胞中的表达。

的制备透射/方正（TF）HIV-1感染性分子Ç 孤小号tocks
以下协议用于从传染性分子克隆（IMC）CH040，CH058，CH077和CH470专门制备TF HIV-1病毒原种。

TF HIV-1质粒的制备
TF质粒的转化
将水浴设置为42 °C。
在冰上解冻一瓶OneShot TM Stbl3感受态细胞5分钟。
加入100 - 200纳克股票TF质粒解冻Stbl3细胞，通过几次轻轻弹管混合。
在冰上孵育细胞30分钟。将Stbl3细胞管放在浮子上，并在42 °C 加热细胞45 s。
热冲击后立即将细胞在冰上冷却5分钟。
添加800 μ 升SOC培养基至细胞。
在200 rpm的摇床上在30°C摇动细胞1小时。
添加300 - 400 μ 升细胞混合物到LB琼脂兼容抗生素（表2）和扩散均匀使用标准方法板。
将LB平板在30°C下孵育过夜（16-18小时）。

表2. TE分子克隆载体对抗生素的耐药性

HIV-1分子克隆

艾滋病试剂计划目录号

载体抗生素耐药性

抗生素浓度（微克/毫升）

CH040

11740

卡那霉素

50

CH058

11856

卡那霉素

50

CH077

11742

卡那霉素

50

CH470

12422

氨苄西林

200

最大准备
选择一个菌落并接种在6 ml含有兼容抗生素的LB肉汤中（表2）。
将LB肉汤在200 rpm下于30 °C 摇动16-18 h。
转移1 ml培养物，并用兼容的抗生素接种到500 ml的LB肉汤中（表2）。
同样，在30℃下以200 rpm摇动500 ml LB肉汤16-18 h。
根据maxi-prep套件的说明执行Maxi-prep。
新产生的TF HIV-1质粒的序列验证
由于TF HIV-1分子克隆的两端均包含相同的重复序列，因此在转化和质粒扩增过程中，质粒会丢失大部分病毒基因组插入片段的情况并不罕见。因此，在生成活病毒储备之前，对maxi-prep产品进行完全测序至关重要。这里包括一组16个测序引物，以确保覆盖质粒中病毒基因组插入片段的整个范围（表3）。

表3. TF HIV-1测序引物

底漆

NT序列

取向

位置
CH040TF（JN944905）

P1

CTCTAGCAGTGGCGCCCGAAC

F

627-647

P2

TTCAGCAAGCCGAGTCCTGCG

[R

710-690

P3

AGACACYATCAATGAGGAAGCTGC

F

1394-1417

P4

TTAAAGGTACYTGAGGTCTGACTGG

[R

8990-8966

P5

CTGARAGACAGGCTAATTTTTTAGG

F

2068-2092

P6

GAAGTTCAAYTAGGAATACCACATC

F

2810-2834

P7

GRYCAATGGACATATCAAATWTATC

F

3548-3572

P8

ATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGC

F

4347-4371

P9

GCCACACAATCATCACCTGCCATC

[R

5070-5047

P10

TAGTGACATAAARGTAGTGCCAAGA

F

4987-5011

P11

TGGGTGTCRWCATAGCAGAATAGGC

F

5776-5800

P12

ACGCCTGTGTACCCACAGACC

F

6431-6451

P13

CAGCACAGTRCAATGYACACATGGA

F

6933-6957

P14

GGGAGCWGCAGGAAGCACTATGG

F

7758-7780

P15

GCAGTAGCTGARRGRACAGATAG

F

8650-8672

P16

AGTGGGBTTYCCAGTCAGACCTC

F

8966-8990

TF HIV-1感染性分子克隆的转染
转染前一周开始293T细胞培养，以便使细胞至少传代两次。这将帮助细胞适应生长条件并提高转染效率。
293T培养基：完全含10％FBS和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。
在传代期间将293T细胞转移到T175培养瓶中。细胞准备好以约60-70％的融合度进行转染。
磷酸钙转染。
试剂：

2 M氯化钙2

2个HBS缓冲区（配方11）

通过0.22 µm 过滤器过滤将两种试剂灭菌，并保存在4°C直至使用。

转染：

（每T175烧瓶）将转染混合物的组成：质粒TF（60 μ 克），H 2 O，2×HBS缓冲液（2ml）中，和2M的CaCl 2 （256 μ 升）。总体积为4毫升。
混合TF质粒和H 2 ：（1744总体积ö μ 升在15ml锥形管）。
加入2 ml 2x HBS缓冲液并充分混合。
轻轻地将CaCl 2 （逐滴）添加到混合物中。
在室温下孵育30分钟，不要混合。
将转染混合物缓慢添加到293T烧瓶中的培养基中，轻轻摇动烧瓶进行混合。
将烧瓶转移到在BSL3装置中孵育（37°C）的细胞培养物中。
注：d UE到高风险与高浓度的TF HIV-1病毒的工作，建议如果可能的话，开展BSL3设施后续步骤。

孵育16小时后，用完全DMEM培养基（配方10）替换转染烧瓶中的一半培养基（〜20 ml），以最大程度地降低磷酸钙对细胞的毒性作用。
收获前再孵育32小时。
收获病毒上清液
将293T烧瓶转移到生物安全罩中。
将培养基倒入50 ml 锥形瓶中，并以500 x g 离心5分钟以去除死细胞和细胞碎片。
附加一个0.45 微米的注射器驱动的过滤器，以除去了柱塞60ml的一次性注射器。
将离心后的培养基倒入注射器中，然后重新插入柱塞并将液体推入新的50 ml锥形管中。
可以将病毒上清液等分，并保存在-80°C直至使用。但是，为确保更高的病毒滴度，建议通过超速离心浓缩上清液。
浓缩TF病毒
将26 ml病毒上清液添加到聚碳酸酯厚壁超速离心管中。
在试管底部的病毒上清液下缓慢加入4 ml 20％的蔗糖溶液（在PBS中）（有底物）。
注意：有关底层技术的详细信息，请在0:43 查看Y outube 视频（https://youtu.be/-SqlIMLUfcI）。虽然视频节目菲underlayed 全血，同样的原则也适用于垫层20％S 在病毒上清ucrose 。

将离心管以100,000 x g 的速度离心2小时（断裂设置为高）。
轻轻倒出上清液，然后将试管倒置在吸收纸层上，以沥干多余的液体5分钟。
添加300-400 μ 升完整的R PMI介质（配方12）有10％FBS和1％青霉素-链霉素。
密封与管P ARA 膜和储存在4℃下过夜，以松开所述病毒颗粒。
轻轻上下移液。避免产生太多气泡以使混合物均质，然后将其分装到小试管中，并在-80°C下储存直至使用。

滴定病毒原种的感染性（TZM-bl分析）
在测定前一周，在完全DMEM培养基中开始TZM-bl细胞培养。
解冻病毒迅速在37℃ 一水：[R洗澡，保持在冰上冷却。
我ñ 一个生物安全罩，使病毒系列稀释液在圆底96孔板。对于浓缩病毒，建议先以1：100稀释（5 µl病毒稀释到495 µl培养基中），然后再进行1：1000稀释（10 µl 1：100稀释到990 µl培养基中），然后再进行5倍5倍稀释（将100 µl的1：100稀释液加入400 µl培养基中，然后以相同的比例混合）。准备TZM-bl细胞时，请将病毒溶液放在冰上。确保包括预先滴定的HIV-1存量作为阳性对照。
胰蛋白酶处理细胞培养瓶以提起TZM-bl细胞。
使用细胞计数器计算上清液中的细胞浓度。
使用10,000 /孔的密度根据测定所需的孔数计算所需的体积。
添加完全DMEM培养基中，以总体积为等效调整到160 μ 升/孔。
添加18.75 μ 克/ ml的硫酸葡聚糖到细胞混合物中，充分混合，然后转移160 μ 升向每个孔上使用多通道移液管96孔白色组织培养处理的无菌微量。
转移40 μ 升病毒稀释到对应的微孔和吹打上下拌匀。加入病毒稀释液后，硫酸葡聚糖的最终浓度应为15 µg / ml。
填充200每个未使用的孔μ 升无菌PBS以降低孵化期间由于蒸发掉的体积。
盖上盖子，孵育48小时。
通过将冻干粉末溶于10 ml BriteLite 缓冲液中来制备BriteLite plus试剂，然后在室温下加热。
在生物安全罩，除去95 μ 升从每孔用多通道移液器用过的培养基的。
分配100 μ 升的BriteLite 加试剂到每个孔中，并通过上下移液充分混合。
让板孵育2-3分钟，然后用发光酶标仪（默认发光设置为1 s）读取。
低于200万的发光读数被认为是有效值。病毒感染性报告为相对光单位（RLU），它是通过将发光读数乘以相应的稀释倍数来计算的。

数据分析

基于p24表达确定感染的LP CD4 T细胞百分比
为了确定生产性感染的LP CD4 T细胞的百分比（图2），根据缺乏活力染料的表达来鉴定存活细胞，然后根据前向散射和侧向散射特性鉴定该群体中的总淋巴细胞。根据前向散射宽度与前向散射高度属性，排除了双峰。通过CD3的表达鉴定总的T细胞。HIV下调CD4 表达，因此CD4 T细胞被鉴定为CD8 - T细胞，而CD3 + T细胞总数。为了建立HIV-1核心抗原（p24）的特异性表达，将模拟条件用作对照。Yoder 等人详细描述了评估p24和GFP共表达的概况。（2017）。

LP CD4 T细胞耗竭的定量
为了量化培养4天后HIV特异性LP CD4 T细胞的消耗，测定了HIV感染培养物与匹配的模拟感染培养物中活LP CD4 T细胞数量的差异（图4）。为了枚举活的LP CD4 T细胞的数量，将在培养期结束时收集的活的LPMC总数（由锥虫蓝排除法确定）乘以使用多色获得的活的LPMC 中CD3 + CD8 - T细胞的百分比流式细胞仪。然后计算相对于模拟的消耗百分比。

图4.使用LPAC模型确定LP CD4 T细胞耗竭的示例计算。线A反映了在培养期结束时基于模拟条件和HIV-1条件的台盼蓝排除计数确定的可行LPMC的总数。线B反映CD3的百分比+ CD8 - LP T细胞活的淋巴细胞的一小部分使用多彩色血流列举cytomet RY。在每种条件下LP的CD4 T细胞的总绝对数量然后CA 通过乘以lculated 与B. 这张图表反映LP的CD4 T细胞中的模拟，并与在相对于HIV的百分比耗尽HIV条件的数量的模拟示出，计算HIV-1条件下的数字/模拟条件下的数字（％）。

分析设计，重现性和统计分析
在培养开始时，将每种条件至少6 x 10 5个细胞接种在三孔中。培养期结束时，将来自一式三份孔的LPMC汇集在一起，计数并评估感染和耗竭。对至少6种不同的供体样品进行测定。执行参数测试。

笔记

这种测定在同一供体的样品中可高度重现。但是，来自不同供体的样品之间存在差异。通过将样品的使用限制为在基线（新鲜融化）时具有> 60％的生存力和> 50％的LP CD4 T细胞（占总LPMC的一部分）的样品，可以将其最小化。此外，我们建议评估每个样品的CCR5基因型/表型，以限制由于CCR5表达而导致的低感染率。

菜谱

隔夜空肠组织保存介质
RPMI补充：

10％人体AB血清

1％青霉素/链霉素/ L-谷氨酰胺

500 微克/毫升佐辛

1.25 微克/毫升两性霉素

1 M HEPES

去除粘液（使用前在37 ° C水浴中孵育）

HBSS补充：

1.67 毫米DTT

500 微克/毫升佐辛

1.25 微克/毫升两性霉素

去除粘液（使用前在37 ° C水浴中孵育）
HBSS补充：

1.67 毫米DTT

500 微克/毫升佐辛

1.25 微克/毫升两性霉素

上皮去除介质（使用前在37 ° C水浴中孵育）
HBSS补充：

1 毫米EDTA

500 微克/毫升佐辛

1.25 微克/米升两性霉素

0.1％牛血清白蛋白

用于LPMC分离的胶原酶培养基（使用前在37 ° C水浴中孵育）
RPMI补充：

10％牛血清白蛋白

1％青霉素/链霉素/ L-谷氨酰胺

500 微克/毫升佐辛

1.25 微克/米升两性霉素

10 微克/毫升DNA酶I

0.5 mg / ml胶原酶D

注意：添加更多的胶原酶D可能会导致细胞表面蛋白的不必要裂解，这可能会影响下游技术（例如流式细胞仪）中特定细胞类型的鉴定。该协议建议将粘膜组织温育超过2个60 分钟，这也可能导致细胞表面蛋白发生不必要的裂解。应该将新批次的胶原酶D的酶活性及其对细胞表面蛋白表达的影响并排比较。避免胶原酶D的多次冷冻/解冻循环，因为这会极大地影响酶的活性。

分离的LPMC的防腐剂
20％二甲基亚砜

80％人体AB血清

解冻媒体
RPMI补充：

10％FBS

1％青霉素/链霉素/ L-谷氨酰胺

10 微克/毫升DNA酶I

文化RPMI媒体
RPMI补充：

10％人体AB血清

1％青霉素/链霉素/ L-谷氨酰胺

500 微克/毫升佐辛

流染色缓冲液
DPBS补充：

1％牛血清白蛋白

2毫米EDTA

1％多聚甲醛
DPBS补充：

1％多聚甲醛

完整的DMEM媒体
DMEM补充有：

10％FBS

1％青霉素-链霉素

2个HBS缓冲区
50 mM HEPES，pH 7.05

10 毫米氯化钾

12毫米葡萄糖

280毫米氯化钠

1.5 mM的Na 2 PO 4

对于1升：

溶解11.92克HEPES，745.60毫克的KCl ，2 0.16克右旋糖，16.36克氯化钠，40.2 克Na 2 PO 4 · 7H 2 ö950毫升水中2 ö
用1 N HCl将pH调节至7.05，用H 2 O 补足至1 L
通过过滤灭菌溶液一0.22微米的FIL 之三，和储存在4℃直至使用
用于TF病毒浓缩的完整RPMI培养基
RPMI补充：

10％FBS

1％青霉素-链霉素

缺乏BSA的改良上皮去除培养基
HBSS补充：

1毫米EDTA

500 微克/毫升佐辛

1.25 微克/毫升两性霉素

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院R01 AI108404（授予CCW）以及R01 AI134220和AI145428（MLS和CCW）的支持。我们要感谢Amanda Steele博士和Eric Lee在LPAC模型开发方面所提供的帮助，感谢Kaylee Mickens提供了图1中的肠道处理图片，并感谢Christine Purba 对该协议进行了严格的审查。我们还要感谢处理LPAC模型中使用的肠组织样本的许多实验室成员以及患者同意将其废弃的手术组织用于研究目的。

竞争我nterests

作者宣称没有利益冲突。

伦理

LPMC从废弃的手术组织样本中获得，患者提供知情同意，可以将这些样本用于研究目的。所有样品都将被实验室人员识别，并在实验室收到时提供ID码。这项研究由科罗拉多州多机构审查委员会（IRB）（COMIRB）进行了审查，符合其根据OHRP和FDA法规由其政策定义的标准，因此被视为“非人类研究” 。

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