材料和试剂

细胞系：携带 VCP R155H / + 突变（GM21752）和年龄匹配的对照（GM00024）的人原代IBMPFD患者成纤维细胞购自Coriell医学研究所（ https://catalog.coriell.org ）。通过感染表达hTERT的逆转录病毒使原代成纤维细胞永生。在嘌呤霉素（1.5 µg / ml）中选择感染的细胞1周，并在1 µg / ml嘌呤霉素中保持
pBABE-puro-hTERT（Addgene质粒，目录号：1771）
液体DME介质（Sigma-Aldrich，目录号：D6429）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F0926）
青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
胰蛋白酶-EDTA（Sigma Aldrich，目录号：T4049）
NMS-873（Selleckchem，货号：S7285）
ML240（Sigma-Aldrich 1346527-98-7）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
Seahorse XFe96 FluxPak（Agilent Technologies，目录号：102416-100），包括传感器盒，校准实用板，96孔培养板，加载指南，校准溶液
无碳酸氢盐的DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D5030）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8636）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
寡霉素（Sigma-Aldrich，目录号：O4876）
CCCP（Sigma-Aldrich，目录号：C2759）
抗霉素A（Sigma-Aldrich，目录号：A8674）
三氯乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：T9159）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
磺胺大黄B（SRB，Sigma-Aldrich，目录号：230162）
Tris base（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
文化媒体（请参阅食谱1）
海马检测介质（请参见配方2）
储备液（请参见配方3）
1. 1 M葡萄糖
2. 200 mM谷氨酰胺
3. 100 mM丙酮酸钠
4. 50 mM寡霉素
5. 100毫米CCCP
6. 50 mM抗霉素A
7. 三氯乙酸溶液
8. 醋酸溶液
9. 磺胺丁丹B溶液
10. 10 mM Tris解决方案
11. 1 mM NMS-873储备溶液
12. 1 mM ML240储备溶液
无碳酸氢盐的DMEM培养基（请参见第4章）

设备

移液器（0.5-10μl，2-20μl，20-200μl，100-1,000μl）
8通道多通道移液器（2-20μl，20-200μl）
Seahorse Biosciences细胞外通量分析仪（型号：XF96或XFe96）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：VWR 15170-168）
37°C，非CO 2 加湿培养箱（例如，Seahorse PrepStation或同等产品）
用于吸光度测量的酶标仪（例如，Tecan Infinite 200或等效产品）

软件

WAVE（Agilent Technologies Seahorse Wave桌面软件，版本2.6或同等版本）

程序

有关完整协议的概述，请参见图1。整个过程包括将人成纤维细胞以低密度接种到Seahorse XF96细胞培养板中，然后进行4-6天的药理处理。治疗后，首先运行Seahorse XF分析以收集氧气消耗率数据。完成后，将每孔的细胞数量归一化，以解决细胞活力和生长方面的差异。

图1.协议的时间安排和概述。在第1天，将细胞铺板并使其附着过夜（步骤1）。从第2天开始，药物治疗会持续4-6天（第2步）。此图显示了为期6天的治疗。在治疗的最后一天（第7天），将Seahorse传感器盒水合过夜（步骤3）。在第8天进行海马检测（步骤4-6）。在第8天分析完成后将细胞固定，并在第8-10天进行归一化（步骤7）。步骤编号参考正文。

将人成纤维细胞接种到Seahorse XF96细胞培养板中（步骤1）
注意：使用无菌技术执行所有步骤。
1. 将培养基，PBS和胰蛋白酶-EDTA溶液预热至37°C。
2. 用PBS洗涤附着的培养成纤维细胞。添加胰蛋白酶-EDTA溶液。等待细胞分离（在37°C下3-5分钟）。加入等体积的培养基以中和胰蛋白酶。将细胞重悬于培养基/胰蛋白酶-EDTA混合物中，并转移至15 ml锥形管中。
3. （可选步骤）：通过在1,000 x g （5分钟，20°C）下沉淀细胞悬液，洗涤细胞，去除上清液，然后将细胞沉淀重悬于2-3 ml培养基中。
4. 一式三份地在血细胞计数器上计数细胞。重悬细胞，最终浓度为每80 µl培养基5,000个细胞。
5. 每孔将80 µl细胞悬液平板接种到Seahorse XFe96细胞培养平板中。留下四个角，不带细胞（ ie ，孔A1，A12，H1，H12充满80μl没有细胞的培养基）。
6. 为了促进均匀铺板，让培养板在组织培养罩中静置30-60分钟，不要打扰。
7. 将板转移到37°C，5％CO 2 培养箱中过夜。
药物治疗（第2步）
注意：使用无菌技术执行所有步骤。
1. 准备含有药物（ eg ，1 nM NMS-873、50 nM ML240）或媒介物（相当于DMSO的量）的新鲜培养基。准备足够的体积至80 µl /孔。
2. 抽真空，从每个孔中移出培养基，并用含有药物或媒介物的新鲜培养基代替。
3. 使平板回到37°C，5％CO 2 培养箱过夜。
4. 在药物治疗期间（例如，4-6天），每24小时重复步骤2a-2c。
水合物传感器盒和稳定仪器（步骤3）
注意：在进行呼吸测量前一天进行一次。
1. 打开一个Seahorse XFe96 FluxPak。从96孔公用板上卸下传感器盒（绿色）。
  注意：请确保不要将打印头倒置放在平坦的表面上，以刮擦打印头上的荧光团。
2. 使用8通道多通道移液器，将200 µl校准溶液加入到效用板的每个孔中。
3. 小心地将传感器盒返回到公用板上。确保不要刮擦荧光团。
4. 将传感器盒和通用板在37°C，非CO 2 培养箱中孵育过夜。
5. 打开Seahorse XF96仪器并启动WAVE软件。确保计算机已连接到仪器，并且温度设置为37°C。保持仪器过夜，以保持温度稳定性。
将细胞洗涤到Seahorse分析介质中（第4步）
注意：在检测开始前约60分钟执行一次。
1. 使用真空，从Seahorse XFe96培养板的每个孔中除去培养基。使用8通道多通道移液器，加回150 µl温暖的Seahorse分析介质。重复三遍。
2. 在最后一次洗涤中，请除去尽可能多的培养基，然后添加150 µl测定培养基。
3. 在测量之前，将板置于37°C的非CO 2 恒温箱中约60分钟。
向盒中装入所需的化合物（寡霉素，CCCP，抗霉素A）（步骤5）
注意：每次连续注射后，最终药物浓度将为5 µM寡霉素，10 µM CCCP和1 µM抗霉素A。
1. 准备以下解决方案（使用从冷冻原料中稀释的药物）：
  2 ml含有80 µM寡霉素的Seahorse分析介质
  2 ml含有170 µM CCCP的Seahorse分析介质
  2 ml含有18 µM抗霉素A的海马测定培养基
2. 使用2-20 µl多通道移液器，将10 µl寡霉素溶液加载到每个孔的端口A中。
3. 使用2-20 µl多通道移液器，将10 µl CCCP溶液装入每个孔的端口B。
4. 使用2-20 µl多通道移液器，将10 µl抗霉素A溶液装入每个孔的C端口。
5. 轻轻向下敲击传感器盒，以确保溶液到达每个端口的底部。
运行分析（步骤6）
1. 在WAVE软件中，设置以下协议：
  校准
  平衡
  基础测量：4个混合周期（3分钟）和测量（3分钟）
  注入（端口A），然后进行4个混合周期（3分钟）和测量（3分钟）
  注入（端口B），然后进行4个混合周期（3分钟）和测量（3分钟）
  注入（端口C），然后进行4个混合周期（3分钟）和测量（3分钟）
2. 开始测定并将传感器盒（装有药物）插入装有校正溶液的效用板顶部的仪器中。确保没有盖子或药物装载指南。
3. 允许仪器校准（15-20分钟）。
4. 仪器完成校准后，卸下公用板并插入Seahorse XFe96电池板。确保没有盖子。
规范化（步骤7）
注释：
1. 可以使用多种方法对海马数据进行归一化，包括细胞计数，细胞染色和蛋白质测量。在这里，我们根据磺基罗丹明B结合固定细胞中存在的蛋白质成分的能力，描述了磺基罗丹明B染色协议以进行标准化（Vichai 等人。，2006）。。
2. 对于标准化过程的每次添加（＃1-5），请使用多通道移液器。
1. 测定完成后，通过将50％TCA溶液直接添加到每个孔中以达到10％的最终浓度来固定细胞。在4°C下孵育板1-24小时。
2. 用蒸馏水洗涤细胞培养板5次，以完全去除所有TCA溶液。完全干燥板（在室温下过夜）。
3. 通过每孔添加25 µl SRB（磺胺多巴胺B）溶液对细胞染色。室温下摇动孵育30分钟。
4. 用1％的乙酸洗涤板5次，以去除残留的SRB。完全干燥板（在黑暗中于室温过夜）。
5. 每孔添加100 µl 10 mM Tris溶液以溶解污渍。室温下摇动培养板30分钟。
6. 使用酶标仪测量510 nm处的吸光度。应该从背景孔（A1，A12，H1，H12）的吸光度信号中减去每个孔的信号。可以将经过背景校正的吸光度值输入WAVE软件，以标准化速率测量结果。
7. 基本氧气消耗率的计算（基本OCR；图2）如下：
  
  残留的OCR（抗霉素A注射后）被认为是背景或非线粒体OCR。
8. 最大耗氧率的计算（Max OCR；图2）如下：
  
  图2.样品耗氧量数据示意图。在典型的海马实验过程中，绘制了标准化耗氧率（OCR）与时间的关系（步骤6）。在指定的时间注射药物（红色），包括寡霉素，CCCP和抗霉素A。如所示计算基础OCR和最大OCR（步骤7）。基础耗氧率（基础OCR）是前4次测量的平均OCR（在注射寡霉素之前）减去后4次测量的平均OCR（在注射抗霉素A后）。最大OCR是CCCP注射后四次测量的最大OCR减去最近四次测量（注射抗霉素A后）的平均OCR。

菜谱

培养基（DMEM + 10％FBS）
445毫升液体DMEM
50毫升胎牛血清
5 ml青霉素/链霉素
通过0.2 µm过滤器过滤/灭菌后进入高压灭菌的玻璃瓶
储存在4°C
使用前加热至37°C
海马检测介质（在检测当天准备新鲜）
8毫升FBS（最终浓度：10％）
0.8 ml的1 M葡萄糖（最终浓度：10 mM）
0.8 ml的200 mM谷氨酰胺（最终浓度：2 mM）
0.8 ml的100 mM丙酮酸（最终浓度：1 mM）
0.8 ml青霉素/链霉素（最终浓度：1％）
68.8毫升无碳酸氢盐的DMEM
将溶液温热至37°C，并将pH值调节至7.4
通过0.2 µm过滤器过滤/灭菌
储存在37°C直到使用
储备液
1. 1 M葡萄糖
  溶于ddH 2 O
  分装并储存在-20°C
2. 200 mM谷氨酰胺
  溶于ddH 2 O。通过0.2 µm过滤器过滤/灭菌
3. 100 mM丙酮酸钠
  溶于ddH 2 O。通过0.2 µm过滤器过滤/灭菌
4. 50 mM寡霉素
  溶于DMSO，等分并在-20°C下储存
5. 100 mM CCCP
  溶于DMSO，等分并在-20°C下储存
6. 50 mM抗霉素A
  溶于DMSO，等分并在-20°C下储存
7. 三氯乙酸溶液
  “在ddH 2 O
  注意：在使用当天准备新鲜，存放在4°C下。
8. 醋酸溶液
  在ddH 2 O
  室温下储存在玻璃瓶中
9. Sulforhodamine B解决方案
  在1％的乙酸溶液中浓度为0.057％（w / v）
  在黑暗中于4°C存放
10. 10 mM Tris解决方案
  ddH 2 O
  室温保存
11. 1 mM NMS-873储备溶液
  溶于DMSO，储存在-20°C
12. 1 mM ML240储备溶液
  溶于DMSO，储存在-20°C
无碳酸氢盐的DMEM培养基
将8.3 g粉末溶解在1 L的ddH 2 O中，通过0.2 µm过滤器进行过滤消毒
储存在4°C

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院（国立衰老研究所），格伦医学研究基金会，娜塔莉·R和尤金·琼斯衰老与神经退行性疾病研究基金会，肯尼斯·格伦家庭基金会的慷慨支持。加州大学洛杉矶分校Laurie和Steven Gordon对帕金森氏症的治疗承诺，以及Renee和Meyer Luskin家庭基金会。

利益争夺

我们没有利益冲突。

参考文献

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瓦茨，GD，怀默，J。，科瓦奇，密西根州，梅塔，SG，穆姆，S。，达维什，D。，佩斯特罗克，A，怀特，MP和基莫尼斯，VE（2004）。与骨骼的Paget病和额颞痴呆有关的包涵体肌病是由突变的含Valosin的蛋白质引起的。 Nat Genet 36（4）：377-381。
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