材料和试剂

移液器吸头
显微镜载玻片（SuperFrost Plus，VWR，目录号：631-0108）
盖玻片（VWR，目录号：470820）
疏水笔，迷你PAP笔（Life Technologies，目录号：008877）
Simport Scientific一次性基础模具（Fisher Scientific，目录号：11670990）
Eppendorf管1.5 ml（Sigma-Aldrich，目录号：Z606340-1000EA）
Sterilin管（赛默飞世尔科技，目录号：129A）＆nbsp;
5毫升Falcon聚苯乙烯圆底管（Fisher Scientific，Corning，目录号：352008）
过滤器50μmFilcon，无菌，注射器型（Becton，目录号：340601）
来自Janvier实验室的野生型C57BL / 6J小鼠
CX3CR1GFP / +小鼠（Jung et al。，2000）
冰
DPBS 1x（Gibco，Life Technologies，目录号：14190-094）
HBSS 1x（Gibco，Life Technologies，目录号：14025-050）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
胎牛血清（Biosera，目录号：FB-1001/500）
皂甙（西格玛奥德里奇，目录号：47036）
Antigenfix（Diapath，目录号：P0014）
最佳切割温度（O.C.T.）Tissue-Tek（VWR，目录号：256008-930）
异戊烷（VWR，目录号：24872-323）
抗体：
1. 抗CD16 / 32（克隆2.4G2，BD Biosciences，目录号：553142，工作稀释度1/200）
2. 抗CD45-BV421（克隆30F11，BD Biosciences，目录号：560501，工作稀释度1/200）
3. 抗F4 / 80-BV785（克隆BM8，BioLegend，目录号：123141，工作稀释度1/200）
4. 抗CD11b-BV605（克隆M1 / 70，BD Biosciences，目录号：563015，工作稀释度1/800）
5. 抗CD64-PerCP / Cy5.5（克隆X54-5 / 7.1，BioLegend，目录号：139308，工作稀释度1/300）
6. 抗CD11c-BV711（克隆N418，BioLegend，目录号：117349，工作稀释度1/300）
7. 抗CD115-PE（克隆AFS98，eBiosciences，目录号：112-1152-82，工作稀释度1/200）
8. 抗Ly6C-APC / Cy7（克隆HK1.4，BioLegend，目录号：128026，工作稀释度1/300）
9. 抗I-A / I-E（MHCII）-PE / Cy7（克隆M5 / 114.15.2，BioLegend，目录号：107630，工作稀释度1/300）
10. Anti-F4 / 80-Alexa Fluor647（克隆BM8，BioLegend，目录号：123122，工作稀释度1/200）
11. 抗MCII-efluor450（克隆M5 / 114.15.2，eBiosciences，目录号：48-5321-82，工作稀释度1/500）
12. 抗M-CSFR（克隆C-20，Santa Cruz，目录号：sc-692，工作稀释度1/800）
13. Anti-rabbit-Alexa Fluor 594（Jackson Immunoresearch，目录号：711-585-152，工作稀释度1/500）
Prolong Gold抗褪色试剂（Life Technologies，目录号：P36930）
Zombie Violet可固定活/死染色（BioLegend，目录号：BLE423113，工作稀释度1/1000）
30％蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）（参见食谱）
用于IF的阻塞缓冲区（参见食谱）
用于IF的洗涤缓冲液（参见食谱）
延长含Sytox蓝染料（Life Technologies，目录号：S34857）（见食谱）
酶消化混合物（见食谱）a。胶原酶II（Worthington Biochemicals / Serlabo Technologies，目录号：LS004174,125 U / mg干重）
一个。胶原酶II（Worthington Biochemicals / Serlabo Technologies，目录号：LS004174,125 U / mg干重）
湾DNase I（罗氏，目录号：10104159001）
C。工作酶消化（500μl/睾丸样品）

设备

移液器
显微镜载玻片架/盒（Heathrow Scientific，目录号：15994G）
立式塑料染色架
解剖剪刀（Harvard Apparatus，目录号：72-8422）
Milligramme balance（Mettler Toledo，目录号：30029085）
SnapFrost80（Alphelys）
低温恒温器（徕卡，型号：CM3050S）
共聚焦显微镜（蔡司，型号：LSM 780）
40x / 1.4油分干涉对比物镜（Plan-Apochromat）
FACS LSRII仪器（BD）
Thermomixer comfort（Eppendorf，目录号：5382000015）
摇摆搅拌器（VWR，目录号：444-0756）
离心分离机
涡流混合器
4°C冰箱
-80°C冰箱

软件

FlowJo（版本10.0.8）
ImageJ（版本1.49s，国立卫生研究院）
Adobe Illustrator CS6（版本16.0.3）

程序
的

为组织睾丸切片准备IF（图1）
1. 通过颈椎脱臼安乐死小鼠。
2. 切除整个睾丸器官并将其直接置于含有1 ml冷Antigenfix的Sterilin管中。在4°C下在摇动搅拌器上孵育3小时。
3. 在冷PBS中将固定的睾丸在4℃下洗涤20分钟。
4. 将睾丸器官在5ml 30％蔗糖溶液中于4℃孵育过夜，直至睾丸完全沉入管底部。
5. 将睾丸转移到冠状平面中的一次性基础模具中，并立即放入SnapFrost80内的冷（-80°C）异戊烷中。 2分钟后，取出冷冻模具并储存在-80°C。
6. 在SuperFrost载玻片上用低温恒温器切割20微米厚的小鼠睾丸，并储存在-20°C。
图1.冠状面睾丸平面准备。将睾丸放入一次性基础模具中，在冠状面上进行OCT。图1.冠状面睾丸平面准备。将睾丸放入一次性基础模具中，在冠状面上进行OCT。
免疫荧光（图2）
1. 将载玻片放入显微镜载玻片架/盒中，用疏水笔划分睾丸切片，每室加入100μlPBS1x，室温（RT）10分钟。
2. 在室温下在封闭缓冲液中孵育1小时。
3. 通过在每次洗涤之间上下移动载玻片架，在室温下用洗涤缓冲溶液洗涤3次，持续5分钟。
4. 将湿纸巾放入载玻片架/盒中，以便形成潮湿的染色室。
5. 与抗体（每节100μl）在PBS / 0.05％皂苷中孵育过夜，在4°C下进行以下稀释：
  1. 抗F4 / 80-Alexa Fluor647稀释度1/200
  2. 抗MCII-efluor450稀释1/500
  3. 抗M-CSFR稀释1/800
6. 在室温下使用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5分钟后，在室温下用抗兔-Alexa Fluor 594（稀释度1/500）孵育1小时，用于抗MCSFR抗体检测。
7. 通过上下移动载玻片架几次，在室温下用PBS / 0.05％皂苷洗涤载玻片三次，每次5分钟。将载玻片放在垂直塑料染色架上，避光，以便干燥载玻片。
8. 在Prolong中装载含有Sytox蓝色染料的载玻片（参见食谱）。
图2.通过IF对间质和肾小管周围巨噬细胞的表型特征。 CX3CR1GFP / +成年小鼠睾丸的IF成像显示间质和管周睾丸的形态，定位，F4 / 80，MHCII和M-CSFR染色巨噬细胞。间质巨噬细胞的一个实例用蓝色箭头表示，显示具有圆形形态并表达CX3CR1，F4 / 80和M-CSFR的细胞。用红色箭头表示管周巨噬细胞的一个实例，显示具有细长形态并表达CX3CR1，F4 / 80和MHCII的细胞。比例尺=40μm。
荧光激活细胞分选（FACS）（图3）
1. 通过颈椎脱臼安乐死小鼠。
2. 收集整个睾丸器官并将其直接置于含有1mg / ml胶原酶II /0.15mg / ml DNase I的冷PBS中的1.5ml Eppendorf管中。通过用剪刀直接在管内切碎来机械解离睾丸。
3. 通过摇动进行酶消化，将切碎的组织置于37℃的恒温混匀器中40分钟。
4. 将消化的睾丸转移至置于5ml Falcon管顶部的50μm过滤器，并使用1ml PBS过滤。
5. 将消化的组织在冷冻离心机中在4℃下以300 x g离心5分钟。
6. 将细胞沉淀重悬于200μl冷PBS中，并与阻断的抗CD16 / 32抗体一起孵育，稀释1/200，将其在冰上保持15分钟。
7. 在1ml冷PBS中洗涤，并在4℃下以300μlg/ g离心5分钟。
8. 将单细胞悬浮液在冷PBS中孵育并染色以在冰上表达表面抗原20分钟。以下抗体用于相同的混合制剂：
  1. 抗F4 / 80-BV785稀释1/200
  2. 抗CD11b-BV605稀释1/800
  3. 抗CD64-PerCP / Cy5.5稀释1/300＆nbsp;
  4. 抗CD11c-BV711（克隆N418，BioLegend，目录号：117349，工作稀释度1/300）
  5. 抗CD115-PE（克隆AFS98，eBiosciences，目录号：112-1152-82，工作稀释度1/200）
  6. 抗Ly6C-APC / Cy7（克隆HK1.4，BioLegend，目录号：128026，工作稀释度1/300）
  7. 抗I-A / I-E（MHCII）-PE / Cy7（克隆M5 / 114.15.2，BioLegend，目录号：107630，工作稀释度1/300）
  8. Anti-F4 / 80-Alexa Fluor647（克隆BM8，BioLegend，目录号：123122，工作稀释度1/200）
  9. 抗MCII-efluor450（克隆M5 / 114.15.2，eBiosciences，目录号：48-5321-82，工作稀释度1/500）
  10. 抗M-CSFR（克隆C-20，Santa Cruz，目录号：sc-692，工作稀释度1/800）
  11. Anti-Rabbit-Alexa Fluor 594（Jackson Immunoresearch，目录号：711-585-152，工作稀释1/500）
  12. Prolong Gold抗褪色试剂（Life Technologies，目录号：P36930）
  13. Zombie Violet可固定活/死染色（BioLegend，目录号：BLE423113，工作稀释度1/1000）
  14. 30％蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）（参见食谱）
  15. 用于IF的阻塞缓冲区（参见食谱）
  16. 用于IF的洗涤缓冲液（参见食谱）
  17. 延长含Sytox蓝染料（Life Technologies，目录号：S34857）（见食谱）
  18. 酶消化混合物（见食谱）a。胶原酶II（Worthington Biochemicals / Serlabo Technologies，目录号：LS004174,125 U / mg干重）
    一。胶原酶II（Worthington Biochemicals / Serlabo Technologies，目录号：LS004174,125 U / mg干重）
    湾DNase I（罗氏，目录号：10104159001）
    温度。工作酶消化（500μl/睾丸样品）