材料和试剂

移液器提示（BioExpress，目录号：P-1236-200）
制造商：Biotix，目录号：P-1236-200CS。
实验室制造的35毫米玻璃底盘（参见视频1制作玻璃底盘）

Video 1. Making glass-bottom dishes. The video elaborates how to make glass-bottom dishes for live-cell single-molecule imaging.
方案中使用的细胞系：小鼠胚胎干细胞和HEK293T细胞
由Luke D. Lavis博士（Janelia Research Campus，Howard Hughes Medical Institute）提供的Janelia Fluor 549染料（JF <549 ）
胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300054）
磷酸缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537-500ML）
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890-100G）
DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D5796）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F0926）
谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25030081）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
β-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21985023）
非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：1114050）
白血病抑制因子（LIF，实验室制作）
FluoroBrite DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：A1896701）
ES细胞培养基（见食谱）
活细胞成像介质（参见食谱）

设备

单通道移液器（BioExpress，Kaysville，USA）
加热器控制器（Warner Instruments，目录号：TC-324）
显微镜（手动显微镜）（ZEISS，型号：Axio Observer D1）
Alpha Plan-Apochromatic 100 / 1.46 NA浸油目标（ZEISS，德国）
演进512 x 512 EMCCD相机（Photometrics，美国图森）
固态激光（智能成像创新，3i LaserStack与光纤）

软件

Slidebook 6.0软件（智能影像创新，丹佛，科罗拉多州）
MATLAB R2015a（8.5.0.197613）（MathWorks，Natlilck，USA）
U-track 2.0（Danusar Lab，UT South Western Medical Center，Dallas，USA）

程序

将稳定表达HaloTag-Cbx蛋白质的100mm板的70-90％汇合细胞（小鼠胚胎干细胞或HEK293细胞）胰蛋白酶化（我们推荐将0.6ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA [1x]用于60mm板，1.5ml用于100mm 盘子）。
种子20％细胞至明胶包被的35毫米玻璃底盘过夜（注1）（见视频2进行凝胶化）。

Video 2. Gelatinization of glass-bottom dishes. The video describes how to gelatinize glass-bottom dishes before seeding cells.
随后通过过夜培养，细胞的最终融合率在80-90％之间。使用几种浓度（5nM，15nM和30nM）的JF 549 ，在37℃，5％CO 2（注释）中与细胞孵育15分钟 2和3）（参见视频3添加JF <549 染料）。

Video 3. Adding JF549 dyes to cells
用ES培养基轻轻洗涤细胞（参见食谱）一次，并在ES培养基中于37℃和5％CO 2孵育30分钟（参见视频4用于洗涤细胞）。

Video 4. Washing cells with ES cell medium
用活细胞成像介质代替ES培养基（参见食谱）（参见视频5添加活细胞成像培养基）。

Video 5. Replacing ES cell medium with live-cell imaging medium
使用加热器控制器在成像期间保持37°C的条件。放置在显微镜上后，每个板片最多可成像1.5小时（见视频6，用于放置目标物）。

Video 6. Placing dishes on objective
通过调整JF 549 染料浓度（注4和5）（参见视频7进行单分子成像），每个细胞核上的个体荧光斑数应在10-50个点之间。/>

Video 7. Single-molecule imaging. The video describes how to image individual HaloTag-Cbx proteins within living cells.
电影然后上传到u-track 2.0。每个单元格都是从较大的电影中剪掉。裁剪的动画被处理（注6）。

数据分析

我们的数据使用MATLAB与u-track 2.0插件进行分析，详细指南可以在 http://www.utsouthwestern.edu/labs/danuser/software/ （软件和pdf文件指南包含在下载中）。
代表性的图像和电影可以在贞氏等等。中找到，

笔记

成像菜肴应胶化过夜。
从成像菜肴中取出培养基时，建议使用移液器，不要吸。
当在成像盘中添加细胞时，建议倾斜平板，慢慢地向下边缘添加介质，让培养基缓慢到达细胞。
所使用的TIRF角度对于单个单元格是独一无二的，应该进行调整以实现最佳的电影。
要获得代表性的电影，电影的焦点应该在核心的中间层。这可以被更深的黑色区域识别（这可以通过调整角度来实现）。光场可用于检查核区。
在u-track 2.0中，可以加载和处理多个动画。处理后，应检查每部电影，以确保细胞不应漂移和旋转。

食谱

ES细胞培养基
DMEM
15％FBS
2 mM谷氨酰胺
100 U / ml青霉素 - 链霉素
0.1mMβ-巯基乙醇
1,000 U / ml LIF
0.1mM非必需氨基酸
活细胞成像介质
FluoroBrite DMEM补充了15％FBS
2 mM谷氨酰胺
100 U / ml青霉素 - 链霉素
0.1mMβ-巯基乙醇
1,000 U / ml LIF
0.1mM非必需氨基酸

致谢

这项工作全部或部分由美国国家卫生研究院国家癌症研究所根据获奖号R03CA191443（至XR）进行了支持。这项工作也得到了丹佛办事处研究处（XR）和美国癌症协会授予IRG 57-001-53（向XR）的赠款的支持。这个协议最初是在臻等人，2016年开发的。

参考

Cuvier，O.和Fierz，B.（2017）。动态染色质技术：从个体分子到细胞中的表观遗传调控。 Nat Rev Genet 。
Grimm，JB，英语，BP，Chen，J.，Slaughter，JP，Zhang，Z.，Revyakin，A.，Patel，R.，Macklin，JJ，Normanno，D.，Singer，RH，Lionnet， Lavis，LD（2015）。一般的改进方法荧光团用于活细胞和单分子显微镜。 Nat方法：12（3）：244-250,243 p在250之后。
Kusumi，A.，Tsunoyama，TA，Hirosawa，KM，Kasai，RS和Fujiwara，TK（2014）。＆lt; a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih。 gov / pubmed / 24937070"target ="_ blank">跟踪活细胞工作中的单分子。 Nat Chem Biol 10（7）：524-532。
Liu，Z.，Lavis，LD和Betzig，E.（2015）。在单分子水平上成像活细胞动力学和结构。分子细胞 58（4）：644-659。
Los，GV，Encell，LP，McDougall，MG，Hartzell，DD，Karassina，N.，Zimprich，C.，Wood，MG，Learish，R.，Ohana，RF，Urh，M.，Simpson，D.，Mendez ，J.，Zimmerman，K.，Otto，P.，Vidugiris，G.，Zhu，J.，Darzins，A.，Klaubert，DH，Bulleit，RF and Wood，KV（2008）。＆lt; a class = "ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18533659"target ="_ blank"> HaloTag：一种用于细胞成像和蛋白质分析的新型蛋白质标记技术。 ACS Chem Biol 3（6）：373-382。
Tatavosian，R.，Zhen，CY and Ren，XJ（2015）。＆nbsp; 染色质生物学中的单分子荧光显微镜方法。 Acs Sym Ser 1215：129-136。
Zhen，CY，Tatavosian，R.，Huynh，TN，Duc，HN，Das，R.，Kokotovic，M.，Grimm，JB，Lavis，LD，Lee，J.，Mejia，FJ，Li，Y.，Yao ，T.和Ren，X.（2016）。活细胞单分子跟踪揭示了H3K27me3和DNA靶标polycomb Cbx7-PRC1与染色质的共识。 Elife 5.
Zheng，Q. and Lavis，LD（2017）。＆nbsp; 开发用于分子成像的光稳定荧光团。 Curr Opin Chem Biol 39：32-38。