材料和试剂

女性Luer线型连接器（西集团，目录号：FTLL210-J1A）
组织纸
注意：通过高压灭菌灭菌实验室纸巾，并保持无菌直到使用。
喷嘴用于生物电喷雾器（0.7φ）（2件）（Nisco Engineering，目录号：PE-00577）
（3件）（VWR，目录号：228-0705）
Falcon TM 将50ml圆锥形离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
75厘米<2>烧瓶（CELLSTAR 细胞培养瓶，Greiner Bio One International）
Sterilin TM 7ml聚苯乙烯Bijou容器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：129A）
2 ml Eppendorf管
20毫升注射器
5 ml注射器
0.22μm注射器过滤器EMD Millipore Millex TM -GP 33mm（Fisher Scientific，目录号：10268401）
制造商：EMD Millipore，目录号：SLGP033RS。
移液管（10ml，25 ml）（CELLSTAR 血清学移液器，Greiner Bio One International）
结核分枝杆菌
注意：可以使用任何菌株或不同种类。
甲基化精神（Fisher Scientific，目录号：11492874）
RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：A1049101）
EDTA粉末（Fisher Scientific，目录号：10522965）
Versene溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15040033）
汉克平衡盐溶液（HBSS），无钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14170112）
HBSS，钙，镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：24020117）
人AB血清（Sigma-Aldrich，目录号：H4522-100ML）
水（Millipore双蒸水，无菌）
超纯海藻酸盐PRONOVA TM UP MVG 10 mg（FMC，NovaMatrix，目录号：4200106）
1N NaOH细胞培养级溶液（Sigma-Aldrich，目录号：S2770-100ML）
1 M HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15630106）
7.5％NaHCO 3溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：25080060）
人类胶原I型（3mg / ml）（Advanced Biomatrix，目录号：5007-A）
0.01N HCl（pH = 2.0）
氯化钙，96％，超纯，粉末，无水，ACROS Organics TM（Thermo Fisher Scientific，目录号：10021681）
制造商：Acros Organics，目录号：349615000。
柠檬酸钠二水合物（Fisher Scientific，目录号：10396430）
3％藻酸盐（w / v）（见食谱）
胶原 - 藻酸盐混合物（1：1比例）（参见食谱）
CaCl 2沉淀浴（参见食谱）
脱壳解决方案（见配方）

设备

烤箱（Genlab干燥炉，英国）
塑料烧杯（2.5升，赛默飞世尔科技）
I / III级生物安全柜
硼硅酸盐晶体玻璃烧杯（VWR，目录号：216-0068）（5个烧杯）
磁力搅拌器（1厘米，5片）
无菌剪刀
Thermo Scientific TM Nalgene TM聚丙烯剪刀式镊子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ）
37℃，5％CO 2培养箱
离心机（Eppendorf，型号：5427 R）
静电珠发生器VARv1（Nisco Engineering，型号：VAR v1）
测试管旋转器（Bibby Scientific，型号：STR4）
PHD ULTRA TM CP注射泵（Harvard Apparatus，型号：PHD ULTRA TM注射泵）
杰克高度调整（Nisco Engineering，目录号：PE-01162）

程序

生物电喷雾预感染的SOP
注意：这是在用结核分枝杆菌过夜感染后外周血单核细胞（PBMC）的封装的优化方案。如果感兴趣的生物体是结核分枝杆菌，读者应该假定实验是在经过认可的实践机构标准的标准生物安全3级实验室中根据I / III级生物安全柜进行的。如果工作需要在标准的生物安全二级实验室进行，则可以在从BSL3实验室取出之前，根据相应的实验室SOP对整个机器进行熏蒸。生物电喷雾技术总是在I / III级生物安全柜中执行，生物电喷雾器的门在微球产生期间保持关闭，作为额外的遏制水平。第二类生物安全柜本身就不能做到这一点。一旦形成微球体，可以将其转移到II级生物安全柜中，或继续进入I / III级生物安全柜。协议三天。修改其他感染或其他生物建模是可能的。
第1天
1. 在塑料烧杯中灭菌以下物品，并在烤箱中烘干。
2. 准备藻酸盐悬浮液。海藻酸盐是一种天然产物，产品的变异性取决于藻酸盐的种类和环境条件。在我们所有的研究中，我们的团队已经进行了所有的程序，所有的程序是用粘度高于250 mPas的中等粘度的G显性藻酸盐进行的。
3. 在没有Ca / Mg的HBSS中，在无菌条件下用酚红制备3％藻酸盐并将其与缓冲液混合以形成藻酸盐混合物。
第2天
1. 准备藻酸盐 - 胶原蛋白基质，如方案2（图1）。
  
  图1.用于包封的细胞的制备从75cm 2烧瓶中回收细胞并通过离心在Falcon中沉淀，然后与藻酸盐 - 胶原基质混合7毫升bijou容器（通常2500万个细胞/ 5毫升的基质混合物）。另见视频1.
  
  Video 1. Mixing alginate with PBMCs prior to bioelectrospraying
2. 根据标准方案提取PBMC，通过密度离心将PBMC与血液分离。可以使用市售的全血分离的PBMC的血沉棕黄层细胞。
3. 在最后洗涤之前，将细胞重新悬浮在50ml CaCl 2中的HBSS中，并取15μl细胞悬浮液进行细胞计数（如果使用从500ml血液中分离的白细胞锥体进一步稀释10倍）。将再悬浮的细胞放在冰箱中直到使用。
4. 计数细胞，并计算重新悬浮在细胞 - 藻酸盐混合物中的5×10 6细胞/ ml终浓度所需的总细胞数。
5. 取出合适数量的分离的PBMC，然后通过在50mL Falcon管中以320×g，8分钟，4℃旋转沉淀。弃去上清液，加入30ml完全RPMI培养基（氨苄青霉素，谷氨酰胺）至PBMC颗粒并重新悬浮。
6. 感染具有适合的Mtb感染（MOI）的PBMC（我们的实验标准是MOI 0.1）。
7. 将感染的PBMC转移到75厘米烧瓶中。
8. 在37℃，5％CO 2培养箱中放置过夜。
第3天
1. 制备用于封装的细胞
  1. 第二天，从培养箱中取出烧瓶;小心地将烧瓶内容物（30ml）转移到50ml Falcon管中。
  2. 向烧瓶中加入5ml 5mM EDTA（或Versene，Thermo Fisher Scientific），并在37℃，5％CO 2培养箱中孵育8-10分钟。
  3. 之后，加入5ml不含Ca，Mg（或完全RPMI培养基）的HBSS至烧瓶中以稀释分离溶液的作用。
  4. 用刮刀仔细刮擦烧瓶底面，轻轻重新悬挂所有残留的细胞
  5. 将10ml内容物转移到已经含有培养基（总共40ml）的相同的50ml的Falcon管中。最后用不含Ca，Mg（或完全RPMI培养基）的10ml HBSS冲洗烧瓶，并加入Falcon。
  6. 通过以320×g离心，8分钟
    在Falcon中的颗粒细胞
  7. 小心地将Falcon管从离心机中取出并倒出上清液。再次悬浮沉淀的细胞：例如，每5×10 6个细胞50μl。
  8. 准备5毫升海藻酸钠胶原混合物在一个7毫升bijou容器。您可以在实验前一周准备藻酸盐胶原蛋白胶囊（视频1）。
  9. 将其细胞与藻酸盐 - 胶原蛋白混合物相应地混合在7毫升的容器中（通常为2500万个细胞/ 5毫升藻酸盐）。
  10. 在冰上/冰箱中保持4°C，直到生物电喷雾细胞藻酸盐悬浮液。
2. 生物电喷雾（图2,3和4）
  
  图2.具有洗涤和酒精消毒臂，无菌喷嘴，无菌硅管和结晶玻璃烧杯的Nisco静电封装剂。 1。喷嘴（0.7φ）附着在喷嘴座上; 2.静电加速器臂用于静电珠发生器VARv1;电极电缆; 4.带末端连接器的硅管;硼硅酸盐晶体玻璃烧杯，带有搅拌器（1厘米）;搅拌器7.静电加速器臂环; 8.用于设定针头高度的标尺。
  
  图3.生物电喷雾微球。将注射器中的基质注入生物电动机中，形成微球。在注射泵（A）上设置填充有基质的注射器，以便将基质注入连接到静电珠发生器的硅管（B）中。注射器驱动器坐在插孔（C）上进行高度调节。 E.生物电喷雾器屋顶上未使用的结晶玻璃烧杯; F.带门的外壳，用于封闭静电珠发生器; G.高压开关开/关（白色，开/绿色，关闭），电位计留在可选的蠕动泵，搅拌器速度和电极上的电压。电压指示器显示7.0 kV。生物垃圾（H）和含有表面活性剂（10％））的旧培养基瓶（I），用于丢弃生物危害废物。
  
  图4.微球在具有100mM CaCl 2的HBSS溶液中形成。胶原藻酸盐与2mm直径硅管中的细胞以特定比例混合，并在胶凝浴中形成微球体。另见视频3.
细胞脱壳
1. 将微球吸入50ml离心管中，使其在管的底部沉降。然后仔细丢弃上清
2. 用不含Ca / Mg的HBSS洗涤微球两次。让微球沉淀在管的底部，然后除去上清液
3. 向胶囊中加入10 ml脱胶溶液。
4. 在室温下孵育15分钟前彻底混合悬浮液。间歇地摇动微球
5. 当微球完全脱胶后，肉眼看不见它们。在室温下，不用Ca / Mg（或完全RPMI）的HBSS填充剩余的管
6. 离心脱胶细胞以320 x g将其沉淀5分钟，弃掉上清液。
7. 通过重新悬浮在HBSS中，然后离心分离细胞沉淀。
8. 通常不需要进一步使用胶原酶。
9. 脱壳细胞可以作为单层进一步培养或用于下游分析。

数据分析

一旦微球形成，人们可以将它们视为个体的细胞/细胞的收集，因为微球是可渗透的，如海绵。微孔可以设置在96孔板中用于测定活力，坏死和凋亡的测定。如果细菌具有发光报道质粒，或者直接通过在脱胶后在Middlebrook 7H11琼脂上计数菌落形成单位，则可以通过发光测量分枝杆菌生长。细胞组成可以通过流式细胞仪在脱胶和多聚甲醛固定后进行分析，通过脱胶和Trizol细胞裂解进行RNA分析。根据标准工作流程分析数据，我们的程序是每个实验变量一式三份的2个独立供体的最小值。

食谱

3％藻酸盐（w / v）

在BSC-II
无菌条件下测量藻酸盐
将约1.5g纯化的藻酸钠（来自NovaMatrix的MVG，高葡萄糖醛酸含量≥60％，粘度> 200mPas，内毒素≤100EU/ g）放入无菌50ml管中

称取无菌空猎鹰管
用海藻酸盐称重猎鹰管
通过减去空的Falcon管的重量来确定藻酸盐的重量
加入不含Ca / Mg的适当体积的HBSS，最终百分比为3％

将管旋转约3分钟，以部分溶解藻酸盐粉末，然后将管置于10 x 10 g的轨道混合器上，或在冷藏室中放置两晚或以上。
将藻酸盐溶液储存在4°C以短期储存（1-2周）或-20°C长期储存（一年）

胶原 - 藻酸盐混合物（1:1比例）

准备以下缓冲区

通过将2.5ml NaOH与10ml HEPES（储备1M）混合，并向最终的50ml NaOH / HEPES溶液溶液中加入37.5ml无内毒素游离水，在0.2M HEPES中加入0.05N NaOH。
100ml 7.5％NaHCO 3

人胶原蛋白（3mg / ml溶于0.01N HCl溶液的水溶液[pH = 2.0]）
将HEPES / NaOH缓冲液，NaHCO 3和藻酸盐如下混合：

3％藻酸盐：总混合物的50％
HEPES / NaOH：总混合物的4.5％
7.5％NaHCO 3：总混合物的9％
用0.22μm过滤器过滤灭菌（Fisher Scientific）
加入人体胶原蛋白（3毫克/毫升）：总混合物的36.5％

将胶原 - 藻酸盐溶液储存在4°C以短期储存（1-2周）或-20°C进行长期储存（长达一年）

CaCl 2沉淀浴

溶解147g CaCl 2·2H 2 O和23.8g HEPES在1L Milli-Q H 2 O中的溶液
将pH值调至5-6
使用0.22μm的过滤器
消毒溶液
沉淀液可以在室温下储存（6-12个月）
在实验当天，将5ml浓缩物与45ml HBSS混合，不含Ca / Mg用于工作溶液

解封装解决方案

准备和消毒以下解决方案

1M柠檬酸钠（在1升Milli-Q H 2 O中加入294.1g）
1M EDTA（在1升Milli-Q H 2 O中加入292.2g）
1M柠檬酸（在1L Milli-Q H 2 O中加入192.1g）
在室温（6-12个月）的细胞培养级塑料容器中储存溶液

用Ca，Mg在HBSS中制备55mM硝酸钠和10mM EDTA，并将pH调节至7.2
准备100ml脱壳溶液
在Ca，Mg的HBSS中混合5.5ml硝酸钠和1ml EDTA，并将pH调节至7.2-7.4并在4℃下储存长达2周

致谢

我们要感谢英国伦敦大学学院的S.N. Jayasinghe所有关于生物电喷雾技术的技术支持和建议。这项工作由美国国家卫生研究所R33AI102239，英国国家3R / NCA / L001039 / 1国家中心和抗菌药物抗性交叉委员会倡议资助，由七个研究委员会MR / N006631 / 1支持。

参考

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