材料和试剂

培养皿（90mm）（GAMA GROUP，目录号：400974）
Needles Omnifix F Duo（B.Braun Melsungen AG，目录号：9161465V）
培养皿3ml，8.8cm 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：153066）
保持微量移液管（Microtech IVF，目录号：001-120-30）
具有长丝的硼硅酸盐薄壁，1.0mm OD 0.78mm ID，150mml（Harvard Apparatus，目录号：300039）
Microloader TM，用于填充Femtotips和其他玻璃微毛细管的尖端，Sterile，0.5-20μl，100mm（Eppendorf，目录号：5242956003）
培养基M16（Merck Millipore Corporation，目录号：MR016D）
4孔细胞培养板（SPLLIFESCIENCES，目录号：30004）
μ-Slide 4井玻璃底部（Ibidi，目录号：80427）
Nunc Lab-Tek II室滑动系统（Thermo Fisher Scientific，目录号：154534）
用于卵母细胞操作的毛细管，尖端直径为100μm
mMESSAGE mMACHINE Kit（Life Technologies，目录号：AM1344）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Ambion?，目录号：
至少6周龄的刺激小鼠（ Mus musculus ，CD1）通过怀孕母马血清促性腺激素（PMSG）-Folligon（MSD动物健康）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）（Sigma-Aldrich）刺激。
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（Sigma-Aldrich，目录号：28822584）
Poly（A）尾部套件（Life Technologies，目录号：AM1350）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Ambion?，目录号： AM1350 "。
RNeasy迷你包（QIAGEN，目录号：74104）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M8410）
无RNase的水（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9932）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Ambion?，目录号：
用于监测液体注入卵母细胞的染料，
1. Fast Green（Sigma-Aldrich，目录号：F1252）
2. 四甲基罗丹明异硫氰酸酯 - 葡聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：T1287）
  设备
  1. 孵化器Hera Cell 150（Heraeus Holding）
  2. 立体显微镜Stemi 2000（ZEISS）
  3. NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific）
  4. 离心机5418（Eppendorf）
  5. 拉拔毛细管（Sutter Instrument Company，型号：P-97）
  6. 用于弯曲毛细管的微型锻造（NARISHIGE Group，型号：MF-79）
  7. 倒置显微镜（OLYMPUS，型号：CKX41和Leica，型号：DMI 6000B）
  8. 通道压力注射器（MicroData仪器，型号：PM2000B 4）
  9. 操纵杆MIS-5000系列显微注射操作系统（Burleigh）
  10. 加压氮气或FemtoJet（Eppendorf）
  11. 共焦显微镜（Leica，型号：SP5）
  12. EMBL阶段培养箱
  13. 水校正目标HCX PL APO 20x/0.7 IMM CORRλBL和HCX PL APO 40/1.1
  软件
  1. 图片J（ http://rsbweb.nih.gov/ij ）
  程序
  1. 制备RNA/morpholinos
    1. 使用mMESSAGE mMACHINE Kit进行您感兴趣的序列（您的RNA或吗啉代寡核苷酸用于阻断选定的特定RNA靶标）的体外 RNA转录，并添加Poly（A）。
    2. 通过RNeasy Mini Kit纯化RNA样品
    3. 通过NanoDrop测量RNA浓度
    4. 使用前将RNA储存于-80℃。
    5. 准备工作溶液与20-50 ng /μl浓度的RNA或1-10μM浓度的吗啉代。在无RNA酶的水中稀释。重要：离心5分钟/17,000×g，并且使用上清液仅除去可能密封微量移液管吸头的颗粒。
    6. 将工作溶液保持在冰上。
  2. 微量移液器准备
    1. 设置微量移液器拉杆上的参数：加热300，拉80，速度70，时间150.
    2. 将毛细管固定到凹槽中，用力拉动支架，关闭盖子并按下拉杆。因此，您可以得到适合显微注射的薄端毛细管（见视频1）。
    3. 然后将毛细管固定到机械手MF-79。放大并聚焦毛细管的端部，并将其关闭到热纤维，将毛细管弯曲到适当的角度，大约30度（见视频1）。
    4. 使用微量加样器吸头向准备好的进样毛细管注入工作溶液（约1.5μl）
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      视频1.微量移液器准备
      
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  3. 卵母细胞分离和培养
    1. 从至少6周龄（6至10周龄）的实验室小鼠（小鼠肌肉，CD1）获得小鼠卵巢，其由Folligon（PMSG;每只小鼠5IU）刺激46小时收集在胚泡（GV阶段）阶段获得卵母细胞。对于受精卵，在PMSG后48小时施用hCG（每只小鼠5IU），并且用男性施用配偶刺激的雌性。分离合子17小时后交配
    2. 安乐死小鼠颈椎脱位。颈部脱位是小鼠安乐死的推荐方法，因为其速度和可靠性（当然在获得适当的技术后）。此外，不会添加任何可能影响实验的化学物质。
    3. 取出卵巢并清除脂肪组织。
    4. 使用两个针在收集卵巢后立即分离卵母细胞：破坏补充有IBMX（100μM）的转移培养基（TM）中的卵泡（参见视频2）。
    5. 将分离的卵母细胞转移到具有IBMX（100μM）的M16培养基的培养皿中，并在37.5℃，5％CO 2下孵育。具有培养基的培养皿必须在37.5℃，5％CO 2中之前平衡至少2小时。
    6. 在孵育器中15分钟后，通过轻轻吹打（吸入和排出数次）孔中的培养基来破坏卵母细胞。移液将机械地从卵母细胞去除卵丘细胞。然后让孵化器中的卵母细胞再培养15分钟。
    7. 然后选择最好的卵母细胞视觉（圆形，核仁在中间，完全生长的卵母细胞直径约70微米;图1）。
      
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      视频2.卵母细胞隔离
      
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      图1.良好和不良卵母细胞的比较。绿色箭头表示良好的卵母细胞。比例尺40μm
  4. 微量注射
    1. 打开显微镜，显微注射器，操纵杆和气体（压力高达500 kPa）。设置注射压力：FILL 0.1 psi，INJ 10.1 psi，BAL 2.9 psi，保持14.5 psi
    2. 将保持毛细管和加载的注射毛细管放入相关的持有人，并用一滴TM + IBMX和卵母细胞慢慢关闭到培养皿。
    3. 然后立即注射：使用保持毛细管（保持毛细管产生负压保持卵母细胞）保持卵母细胞，并注射?5 pl的工作溶液从注射毛细管卵母细胞，不靠近细胞核（图2）。
    4. 转移卵母细胞与构造到孵化器在M16 + IBMX
    5. 验证显微注射的成功使用荧光显微镜
    6. 参见视频3.
      
      图2.显微注射。注射工作溶液不靠近细胞核。
      
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      视频3.微注射
      
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  5. 活细胞成像
    1. 显微注射后1-2小时从TMX中的IBMX洗涤卵母细胞，然后在M16中洗涤
    2. 将卵母细胞转移到2微升M16覆盖油在Lab-tek室幻灯片系统。具有培养基的培养皿必须在37.5℃，5％CO 2中平衡。抬高的盖玻片不合适。我们也使用来自Ibidi的菜（1.5H），类似于Labtek。或者，对于细胞培养（不用于卵母细胞），您可以选择例如μ-Slide I Luer Family的培养皿。
    3. 将您的样品在配备有EMBL阶段培养箱（37.5℃，5％CO 2）的共聚焦显微镜。确保孵化器关闭。
    4. 打开相应的激光器并设置视频捕获软件（图像每5-15分钟）。我们通常让小鼠卵母细胞培养过夜，但是根据各染料的化学性质，漂白等，公布了一个星期以上的胚胎培养。。
    5. 使用Image J汇编影片（ http://rsbweb.nih.gov/ij ）。
    6. 参见图3和视频4，显示使用H2B-GFP mRNA的小鼠卵母细胞减数分裂成熟的可视化
      
      图3.小鼠卵母细胞减数分裂的可视化。使用显微注射的H2B-GFP（绿色）进行可视化。 A.在GV阶段完全成熟的卵母细胞。 B.核细胞包膜破坏（NEBD）和典型的染色体扩散后的卵母细胞。 C.卵母细胞在中期I（MI）阶段。 D.卵母细胞在后期I. E.卵母细胞在第一次减数分裂后挤出第一极体
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      视频4.小鼠卵母细胞在减数分裂成熟与显微注射H2B-GFP。对照卵母细胞未显微注射（黄色箭头），显示H2B-GFP 在绿色。生长卵母细胞（蓝色箭头）没有减数分裂能力和保持在GV阶段。
  食谱
  1. 传输介质
    NaCl 12.8g
    KCl 0.8g
    CaCl 2 2 2H 2 O 0.6g
    
    。
    
    MgSO 4 .0.747g。</b> 7H 2 O 0.194g< br / Glukose 4 g
    4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）4g / 聚乙烯醇（PVA）2 g
    蒸馏水2 L
    牛血清白蛋白（BSA）5g
  致谢
  
  这项工作是由研究基金GACR 13-12291S支持Andrej Susor。原始的工作发表在Karabinova等人（2011）和Susor等人（2015）。感谢生物化学和分子生物学实验室的同事支持。
  
  参考文献
  1. Gagnon，J.A。和Mowry，K.L。（2010）。在"Xenopus卵母细胞"中可视化RNA定位。 J Vis Exp （35）：e1704。
  2. Karabinova，P.，Kubelka，M。和Susor，A。（2011）。哺乳动物卵母细胞减数分裂和受精中泛素化蛋白的蛋白酶体降解。细胞Tissue Res 346（1）：1-9。
  3. Layden，M.J.，Rottinger，E.，Wolenski，F.S.，Gilmore，T.D.and Martindale，M.Q.（2013）。在小星海葵中显微注射mRNA或morpholinos用于反向遗传分析，Nematostella vectensis/em> Nat Protoc 8（5）：924-934。
  4. Susor，A.，Jansova，D.，Cerna，R.，Danylevska，A.，Anger，M.，Toralova，T.，Malik，R.，Supolikova，J.，Cook，MS，Oh，JSand Kubelka，（2015年）。通过mTOR-eIF4F通路在哺乳动物卵母细胞中翻译的时空和空间调节。 Nat Commun 6：6078.
  5. Yuan，S.and Sun，Z.（2009）。在斑马鱼胚胎中显微注射mRNA和吗啉代反义寡核苷酸。（27）：e1113。