材料和试剂

使用大约10天（作为配子体的最早期的子叶小立碗藓（Physcomitrella patens subspecies patens）（Gransden））的生长旺盛的组织作为组织，并且从Ralph S.Quatrano（Department of Biology，Washington University in St.Louis， MO 63130，USA）
200毫升无菌蒸馏水
喷雾瓶中70％的酒精（用于表面灭菌）
生长培养基（参见食谱）

设备

1L烧瓶中，其中制备生长培养基
无菌培养皿（90毫米）
无菌玻璃纸碟
无菌镊子
无菌试管（25×150mm）
微孔手术胶带
无菌移液器（1 ml）
无菌提示（1 ml）
配药仪器（，例如，IKA T 10基本ULTRA-TURRAX®）
层流柜
高压灭菌（例如，Sanyo，型号：MLS-3780）

程序

注意：步骤2-12应在无菌条件下进行。

根据表1制备BCDA培养基，并在121℃下用高压灭菌器灭菌20分钟;
在层流罩中用70％酒精进行表面灭菌;
将培养基冷却至60℃，并将约30ml BCDA培养基倒入无菌培养皿（90mm）中。使其冷却直至介质固化; 将一块无菌玻璃纸碟放在BCDA培养基上（视频1）;

视频1.将一块无菌玻璃纸光盘放在BCDA介质上
将一个陪替氏培养皿组织（强力生长的组织）放入一个试管（视频2）;

视频2.将一个培养皿组织放入一个试管中
向一个无菌试管（含有一个培养皿组织）中加入6-8ml的H 2 O，并使用分配仪器以约15,000rpm的速度将其切成片段1-2分钟;
吸取1-2毫升来自步骤6的质子凝胶悬浮液到步骤4的每个培养皿上。通过轻轻地旋转平板（视频3）将悬浮液均匀地扩散;

视频3.吸取1-2毫升来自步骤6的质子悬浮液到步骤4的每个培养皿上。通过轻轻地旋转平板
用微孔手术胶带密封培养皿;
将这些片段在标准条件（25℃）下孵育6-7天，光周期为16小时/8小时黑暗，光强度为70-80μmol/s/m 2 >;
在相同的培养条件下，将组织（玻璃纸上的）1-2块（在玻璃纸上）转移到BCD固体培养基（表2）上3-4天，以进行下一个循环的步骤9（这是大约生长的组织， ;视频4）;

视频4.将1-2碟的组织转移到BCD固体培养基上3-4天，在相同的培养条件下进行下一个周期的步骤9
收获来自步骤9的组织（来自步骤9的马铃薯的电子照相），用于使用无菌镊子从玻璃纸刮下它们用于下游分析。
对于组织原料，取10d旧组织的微量（约2毫升，使用无菌镊子）到具有BCD培养基的无菌试管中。包装在铝箔管和存储在4°C。它们保持活力约六个月。

食谱

生长培养基

表1. BCDA培养基配方

试剂	数量（1 L）	最终集中
解决方案B	10 ml	1mM MgSO 4
解决方案C	10 ml	1.84mM KH 2 PO 4
解决方案D	10 ml	10 mM KNO 3
CaCl <2>	111 mg	1 mM
FeSO 4 ^。 7H <2> O	12.5 mg	45μM
（NH 4）2 2 CH 4 H 4 O 6 6	0.92克	5 mM
Agar	7.5克	0.75％（w/v）
葡萄糖	5克	0.5％（w/v）
Hoagland的A-Z跟踪	1 ml	微量元素溶液
H sub 2 O	到1 L

表2. BCD介质配方

试剂	数量（1 L）	最终集中
解决方案B	10 ml	1mM MgSO 4
解决方案C	10 ml	1.84mM KH 2 PO 4
解决方案D	10 ml	10 mM KNO 3
CaCl <2>	111 mg	1 mM
FeSO 4 ^。 7H <2> O	12.5 mg	45μM
Agar	7.5克	0.75％（w/v）
葡萄糖	5克	0.5％（w/v）
Hoagland的A-Z跟踪	1 ml	微量元素溶液
H sub 2 O	到1 L

表3.解决方案B，C，D和Hoagland的A-Z跟踪的配方

	试剂	数量（1 L）	最终集中
解决方案B	MgSO 4。。 O	25克	0.1 M
解决方案B	H sub 2 O	到1 L
解决方案C	KH ₂ PO ₄	25克	184 mM
解决方案C	H sub 2 O	到1 L	用KOH 调节pH至6.5
解决方案D	KNO ₃	101克	1 M
解决方案D	H sub 2 O	到1 L
Hoagland的A-Z跟踪	Al <2>（SO 4 ）₃ ^。 K sub 2 SO SO 4 ^。 24H ₂ O	55毫克	0.006％（w/v）
	COCl <2> ^。 6H <2> O	55毫克	0.006％（w/v）
	CuSO 4 ^。 5H sub 2 O	55毫克	0.006％（w/v）
	H ₃ BO ₃	614 mg	0.061％（w/v）
	KBr	28 mg	0.003％（w/v）
	KI	28 mg	0.003％（w/v）
	LiCl	28 mg	0.003％（w/v）
	MnCl 2 ^。 4H O	389 mg	0.039％（w/v）
	SnCl 2 ^。 2H <2> O	28 mg	0.003％（w/v）
	ZnSO 4 。 7H O	55毫克	0.006％（w/v）
	H sub 2 O	到1 L

将溶液B，C，D和Hoagland的A-Z痕迹灭菌，然后在4℃或室温下贮存。

致谢

这项工作得到了北京自然科学基金（编号：5132004），中国博士后科学基金和国家教育部侨务科学研究基金会对王博士的资助。

参考文献

Ashton，N.W。，和Cove，D.J。（1977）。在青苔Physcomitrella patens中分离和初步表征营养缺陷型和类似物抗性突变体。 Mol Gen Genet 154，87-95。
Boyd，P.J.，Hall，J.，and Cove，D.J。（1988）。用于培养小立碗藓的空气发酵罐。 In：Glime，J.M。（ed）。 Hattori植物学实验室，41-45。
Cove，D.J.，Perroud，P.F.，Charron，A.J.，McDaniel，S.F.，Khandelwal，A.and Quatrano，R.S.（2009）。青苔Physcomitrella patens ：一种用于植物发育和基因组的新型模型系统 Cold Spring Harb Protoc 2009（2）：pdb emo115。