材料和试剂

台南67
注意：TNG67是一种精英粳稻品种，自1978年推出以来，已经是台湾一个领先品种超过30年。
SA0420
注意：通过叠氮化钠诱变开发的TNG67突变库中选择了一种芳香突变体，表现出可接受的类芋香味。
液氮
丙酮（Merck KGaA，目录号：1.00012.4000）
NH 4 OAc（Merck KGaA，目录号：1.01116.1000）
DTT（Merck KGaA，目录号：1.11474.0001）
CHAPS（GE Healthcare，目录号：17-1314-01）
HCl（Merck KGaA，目录号：1.09063.1000）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
（Merck KGaA，目录号：1.09634.2500）
甲醇（Merck KGaA，目录号：1.06007.4000）
NaCl（Merck KGaA，目录号：7710CN）
NaOH（Merck KGaA，目录号：1.06469.1000）
KCl（Merck KGaA，目录号：1.04936.1000）
PMSF（Merck KGaA，目录号：52332）
苯酚（饱和的，pH6.6/7.9）（AMRESCO，目录号：0945）
PVPP（Merck KGaA，目录号：1.07302.0100）
Seasand（Merck KGaA，目录号：107711）
蔗糖（GERBU Biotechnik GmbH，目录号：1366）
Triton X-100（GERBU Biotechnik GmbH，目录号：2000）
Tris-base（AMRESCO，目录号：0497）
尿素（AMRESCO，目录号：0378）
Miracloth（Calbiochem ，目录号：475855-1R）
提取缓冲液（参见配方）
沉淀缓冲液（参见配方）
0.5 M EDTA（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
40 mM PMSF（参见配方）

设备

砂浆（Φ9cm）和杵（附有Φ12cm砂浆）（图1）

图1.砂浆和杵
Pipetman（Gilson，型号：p5000，p1000，p200，p100，p20和p10）
高速冷冻离心机和46转子（日立，型号：himac CR22F）
50ml离心管（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ，型号：3119-0050）
-20℃冰箱（Firstek Scientific，型号：F-25）
SpeedVac系统（Thermo Fisher Scientific，型号：SPD speed Vac和UVS400通用真空系统）
超声波机（ULTRASONIC，型号：LC130H）
化学通风橱（CHUNG FU，型号：HAP-090）

程序

从水稻叶子制备蛋白质样品
1. 将0.5g新鲜或-80℃冷冻叶样品切成小块，加入小海沙（图2A），并通过倾倒液体冻结组织在研钵切割的叶子上的氮气（视频1）
2. 使用研钵和研杵将组织研磨成细粉末（图2B，视频1）
3. 加入5毫升提取缓冲液，立即研磨样品直到发泡（图2C，视频1）
4. 加入0.5g PVPP并完全研磨。然后加入5毫升提取缓冲液，研磨样品直至发泡（视频1）
5. 加入250μl40mM PMSF和5ml提取缓冲液，然后研磨混合物直至起泡（视频1）。
6. 将匀浆转移到无菌的50ml离心管（视频1）。
7. 剩余的植物材料粘在砂浆和杵上被救出通过用5ml提取缓冲液小心地冲洗研钵和杵，和倒入管中并与匀浆充分混合（视频1）
8. 以15,000rpm离心20分钟（在No.46转子中），4℃。
9. 将上清液通过2层Miracloth过滤到另一个新管中（图2F）
10. 用等体积的缓冲液饱和苯酚提取滤液（约16ml）。通过反转混合均匀。以15,000rpm离心20分钟，4 ℃。
11. 将顶层（苯酚相）转移到另一个新管中（图2G和2H）
  
  图 2.蛋白质样品的制备。 A-E。叶被研磨和提取通过提取缓冲液。 F-H。蛋白质样品通过苯酚纯化提取
12. 用等体积的苯酚相萃取冷提取缓冲液两次（分别为第一次14ml和第二次12ml）。通过反转混合均匀。在15,000rpm，4℃下离心20分钟。恢复顶层（苯酚相）。
13. 向回收的苯酚相中加入3倍体积的冷却的沉淀缓冲液，通过倒置充分混合
14. 在-20°C孵育4小时（或甚至过夜）以沉淀蛋白质。然后在15,000rpm，4℃下离心20分钟并弃去上清液
15. 用1.8 ml沉淀缓冲液洗涤沉淀两次。通过在8,000rpm离心5分钟来回收沉淀
16. 用1ml含有0.7μl的冷的100％丙酮洗涤沉淀 2-巯基乙醇（14.3M）。通过离心回收沉淀 8,000 rpm，5分钟。
17. 通过SpeedVac干燥沉淀约2-3分钟（小于5分钟），并重悬于适当体积的裂解缓冲液中。
18. 蛋白质样品可以通过Bradford方法（Bradford，1976）定量并储存在-20℃
19. 获得的蛋白质样品可用于蛋白质组分析（Lin等人，，2014; Liu et al。，2012）或Western印迹（Lin和Jeang，2005）（图3）。
  
  图3.蛋白质组学分析和蛋白质印迹分析 A.来自各种水稻品种的叶蛋白的蛋白质组学分析。乙。芋螺叶蛋白的蛋白质组学分析和western blotting探测与抗SSSI（Lin和Jeang，2005）。
从米粒制备蛋白质样品
1. 通过液氮冻结0.5g脱壳谷物（无谷物的谷物）
2. 将冷冻的组织放在含有少许海水和砂浆的砂浆中液氮。使用研钵将组织研磨成粉末杵
3. 加入10ml提取缓冲液，含有140μl40mM PMSF。研磨样品2分钟或匀浆，然后转移到灭菌的50ml离心管
4. 以15,000rpm离心20分钟（在No.46转子中），4℃。将上清液转移到另一个新管中
5. 向回收的苯酚相中加入3倍体积的冷0.1M NH 4 OAc /甲醇/10mM 2-巯基乙醇，并通过倒置充分混合。
6. 在-20°C孵育4小时（或过夜）以沉淀蛋白质。然后在15,000rpm，4℃下离心20分钟，弃去上清液
7. 用1.8ml 0.1M NH 4 OAc /甲醇/10mM洗涤沉淀 2-巯基乙醇。通过在8,000离心回收沉淀 rpm，5分钟
8. 用1ml冷的100％丙酮洗涤沉淀含有0.7μl2-巯基乙醇（14.3M）。通过回收丸在8,000rpm离心5分钟
9. 干燥颗粒 SpeedVac系统约2-3分钟（少于5分钟）并重悬于适当体积的裂解缓冲液
10. 蛋白质样品可以通过Bradford方法（Bradford，1976）定量并储存在-20℃
11. 获得的蛋白质样品可用于蛋白质组分析或Western印迹。

代表数据

视频1.蛋白质提取

笔记

在本协议中，影响蛋白质样品的产量和完整性的关键步骤如下：
1. 不建议使用冻干样品，因为有些脱水蛋白质可能难以溶解在提取缓冲液中
2. 完全均匀化可以通过在提取缓冲液中研磨样品来实现（见视频1）
3. 在步骤B9中不要将颗粒干燥太久。它需要大约2-3分钟（小于5分钟）。过度干燥的丸将非常困难重悬并完全溶解在裂解缓冲液中
4. 蛋白质样品的重悬可以通过放置Eppendorf来实现将含有蛋白质溶液的管置于冰冷的超声波处理中浴（图4）
  
  图4.用超声波溶解蛋白质左面板是超声波机。右面板显示蛋白质样品在超声波处理的冷浴中重悬。
苯酚废物必须单独存放在可以正确密封的玻璃瓶中。苯酚废物必须根据相关机构的化学废物规定进行废弃

食谱

提取缓冲区
23.96克蔗糖
6.05克Tris-碱
10ml 0.5M EDTA（pH8.0） 0.75克KCl
250μlHCl
2ml 2-巯基乙醇将dH <2> O添加到100 ml
注意：此缓冲液应该新鲜制备，并在4°C预冷。
降雨缓冲液
1.54g NH 4 OAc
140μl2-巯基乙醇（14.3M）加入甲醇至200ml，贮存于-20℃
0.5 M EDTA（pH 8.0）
186.1g EDTA
800ml dH 2 O
用NaOH（约20g NaOH）将pH调节至8.0 将dH 2 O加入到1,000ml中，高压灭菌并在室温下贮存
裂解缓冲液
57克尿素
4ml Triton X-100 4克CHAPS
484.4mg Tris-碱
231.4毫克DTT
将dH 2 O加到100ml中，以1ml /管分配并储存在-20℃下。
40mM PMSF
6.96mg PMSF
加入2-丙醇至1ml，在-20℃下贮存

致谢

该方案通过改进苯酚 - 甲醇法（Hurkman和Tanaka，1986）开发。作者承认农业理事会（91-3112-P-055-001-Y）和国家科学理事会（NSC 95-2317-B-005 -01，NSC 96-2317-B-005- 01）。我们还感谢台湾农业研究所生物技术部的Yu-Hisn Yeh小姐帮助准备图片和视频。

参考文献

Bradford，M.M。（1976）。利用蛋白质染料结合原理的快速灵敏的微克量蛋白定量方法。 Anal Biochem 72：248-254。
Hurkman，W.J.and Tanaka，C.K。（1986）。通过二维凝胶电泳分析植物膜蛋白的溶解性。植物生理学81（3）：802-806。
Lin，D.G。和Jeang，C.L。（2005）。来自芋头的可溶性淀粉合成酶I cDNA的克隆，表达和表征（ Colocasia esculenta Var。 esculenta ）。 J Agric Food Chem 53（20）：7985-7990。
Lin，D.G.，Chou，S.Y.，Wang，A.Z.，Wang，Y.W.，Kuo，S.M.，Lai，C.C.，Chen，L.J.and Wang，C.S。（2014）。水稻品种TNG67及其高芳香突变体SA0420的蛋白质组学研究 Plant Sci 214：20-28。
Liu，C.W.，Hsu，Y.K.，Cheng，Y.H.，Yen，H.C.，Wu，Y.P.，Wang，C.S.and Lai，C.C。（2012）。水稻根中盐反应性泛素相关蛋白的蛋白质组学分析。 Rapid Commun Mass Spectrom 26（15）：1649-1660。