水稻细胞表面和截面的扫描电镜观察
Observation of Cell Surface and Cross-sectional Structure of Rice Tissue by Scanning Electron Microscopy   

材料与试剂

1. 2 ml离心管
   
2. 吸管
   
3. 注射器
   
4. 牙签
   
5. 滤纸
   
6. 水稻组织
   
7. 无水乙醇 (国药试剂)
   
8. 醋酸异戊酯 (国药试剂)
   
9. 液态二氧化碳 (国药试剂)
   
10. 戊二醛 (进口品质试剂)
    
11. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液 (见溶液配方)
    
12. 脱水剂 (见溶液配方)
    
13. 固定剂 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 通风橱
   
2. 干燥器 (国产)
   
3. 冰箱
   
4. 临界点干燥仪 (HITACHI HCP-2，Japan)
   
5. 离子溅射仪 (JEOL JFC-1600，Japan)
   
6. 扫描电镜 (JEOL JSM-6390/LV，Japan)
   
7. 用具：手术剪刀、眼科镊子、量筒、烧杯、小笼子
   

实验步骤

1. 取样：目的水稻组织切成9 mm³的小块，每份样品至少取10个小块，迅速置于2.5%戊二醛固定液中，抽真空2 h，4 °C或室温固定一周以内。不同水稻组织取样要求：组织要在固定液中剪切。叶片切成3 x 3 mm小块；观察花粉粒直接取花药进行固定，粘样后再将花粉粒拨出；观察花原基或叶原基最好是将花序或叶序固定后再拨出原基。
   
2. 脱水：依次通过乙醇梯度30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%逐级脱水每级10 min，样品块大的应适当摇动，保证脱水干净。70%乙醇中可以放过夜。
   
3. 醋酸异戊酯替换：醋酸异戊酯:乙醇=1:1的混合液浸泡样品10 min，再用纯醋酸异戊酯浸泡10 min，适当摇动。将样品按照不同的编号转入对应编号的小笼子。醋酸异戊酯有刺激性气味，此步要在通风橱内操作。
   
4. 临界点干燥：提前打开临界点干燥仪预冷1 h以上。将装有样品的小笼子放进预冷的临界点干燥仪样品室内，充分拧紧样品室盖子后注入液体二氧化碳至淹没样品为准，先升温至15 °C加温10 min，再升温至35 °C让二氧化碳气化，观察液体全部气化后慢慢放气。放气速度一定要慢，放气过程至少要持续3 h以上。必须等气体放净后才能开盖取出样品。
   
5. 粘样：样品台上粘双面的导电胶，将要观察的样品表面向上粘在导电胶上。粘样时，不能碰到要观察样品的表面。要观察截面的样品，用双面剃须刀片滑切出样品截面，截面向上将样品薄片粘在导电胶上。
   
6. 喷金：将样品台放在离子溅射仪中，打开仪器开始抽真空，当真空达到5.0 Pa后，点start按钮进行喷金。
   
7. 扫描电镜观察：样品台固定在样品座上，放入扫描电镜样品仓，抽真空待HT变蓝后，加高压，选择感兴趣区域放大聚焦，SCAN3慢扫获得照片。
   

注意事项

1. 水稻叶片正面反面有较大差异，粘样时注意正反。
   
2. 观察水稻叶片气孔取样植株最好在苗期，较老植株微管组织发达，气孔内陷及表面附属物很多不易观察气孔开闭。
   
3. 水稻叶片抽真空不易下沉，可先用纱布塞在上面将叶片在液面以下，再反复抽真空几次直至叶片自然沉入管底。
   
4. 观察水稻茎端分生组织，剥去外面叶片及叶鞘时应非常细心，极易破损或剥离不完全。
   

溶液配方

1. 0.1 M PBS, pH 7.2缓冲液
   A液：NaH₂PO₄.2H₂O 31.21 g 定容到1,000 ml
   B液：Na₂HPO₄.12H₂O 71.64 g 定容到1,000 ml
   取A液28 ml，B液72 ml配制成0.2M PBS缓冲液，然后用蒸馏水稀释成0.1 M的工作液
   
2. 脱水剂
   30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和无水乙醇
   
3. 固定剂
   2.5%戊二醛 (进口品质试剂，0.1 M PBS, pH 7.2配制)