Gibson Cloning
1 试剂的准备
1.1 Phusion DNA Polymerase
货号：NEB的#M0530S 2000U/ml Phusion® Hot Start Flex DNA Polymerase
Catalog #: M0536S , M0536L
Function：High Fidelity DNA Polymerases are important for applications in which the DNA sequence needs to be correct after amplification. Phusion High-Fidelity DNA Polymerase offers both high fidelity and robust performance, and thus can be used for all PCR applications. Its unique structure, a novel Pyrococcus-like enzyme fused with a processivity-enhancing domain, increases fidelity and speed. Phusion DNA Polymerase is an ideal choice for cloning and can be used for long or difficult amplicons. With an error rate 50-fold lower than that of Taq DNA Polymerase and 6-fold lower than that of Pyrococcus furiosus DNA Polymerase , Phusion is one of the most accurate thermostable polymerases available. Phusion DNA Polymerase possesses 5´→ 3´ polymerase activity, 3´→ 5´ exonuclease activity and will generate blunt-ended products.
作用：高保真DNA聚合酶在DNA序列扩增后的正确匹配性是重要的。该款DNA聚合酶提供高保真度和执行的随意性，因此可用于所有PCR扩增。根据其独特的蛋白结构，一种新型的似球菌的酶与强化过程的结构域组成，提高保真度和速度。DNA聚合酶是一个理想的克隆选择，可用于长片段或困难片段的扩增。Phusion是最精确的热稳定性聚合酶之一，其错误率比Taq DNA聚合酶低50倍，比糠秕焦球菌DNA聚合酶低6倍。DNA聚合酶具有5’到3’聚合酶活性，3’到5’外切核酸酶活性，能够产生平末端产物。
1.2 T5 Exonuclease
货号：NEB的#M0363S 10000U/ml
Catalog #: M0363S , M0363L
Function：T5 Exonuclease degrades DNA in the 5´ to 3´ direction . T5 Exonuclease is able to initiate nucleotide removal from the 5´ termini or at gaps and nicks of linear or circular dsDNA . However, the enzyme does not degrade supercoiled ds DNA . T5 Exonuclease also has ssDNA endonuclease activity.
作用：T5核酸外切酶从5’至3’降解DNA。T5核酸外切酶能够从5’末端或在线性与环状双链DNA的间隙和缺口中开始去除核苷酸。然而，该酶不降解超螺旋的双链DNA。T5核酸外切酶也具有单链线性DNA核酸内切酶活性。
1.3 Taq DNA Ligase
货号：NEB的#M0208L 4000U/ml
Catalog #: M0363S , M0363L
Function：Taq DNA Ligase is a thermostable ligase that catalyzes the formation of a phosphodiester bond between the 5´-phosphate and the 3´-hydroxyl of two adjacent DNA strands. The strands to be ligated need to be hybridized and accurately paired, with no gap, to a complementary DNA strand; allowing resolution of single nucleotide variants. Taq DNA Ligase uses NAD as a cofactor and it is active at elevated temperatures (37° C – 75° C).
作用：Taq DNA Ligase是一种热稳定性连接酶，催化两个相邻DNA链的5-磷酸和3-羟基之间形成磷酸二酯键。要连接的链需要杂交，并且精确配对，没有间隙，与互补的DNA链；允许单核苷酸变异体的解析。Taq DNA连接酶使用NAD作为辅因子，它在升高的温度（37°C～75°C）下是活跃的。
1.4 NAD
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate
(二磷酸吡啶核苷酸, 辅酶 1, 辅酶 A, 辅酶)
货号：Sigma的V900401-5G
Catalog #: V900401 经验分子式（希尔表示法） C21H27N7O14P2 · xH2O 分子量 663.43 (anhydrous basis)
Function： Taq DNA Ligase uses NAD as a cofactor and it is active at elevated temperatures (37° C – 75° C).
作用： Taq DNA连接酶使用NAD作为辅因子，它在升高的温度（37°C～75°C）下是活跃的。
1.5 PEG 8000
Poly(ethylene glycol)
中文名：聚乙二醇
货号：vetec的V900156-500G
Catalog #: V900156线性分子式 H(OCH2CH2)nOH
1.6 Tris base
Trizma® 碱
中文名: 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇, THAM, Tris 碱, 三羟甲基氨基甲烷, 氨基丁三醇
货号：Vetec的V900483-500G
Catalog #: V900483线性分子式 NH2C(CH2OH)3 分子量 121.14
1.7 Glycerol
中文名: 甘油，丙三醇
货号：国药的10010618
分子式：C2H3O3 分子量 92.09
1.8 EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
中文名: 乙二胺四乙酸, 亚乙基二次氮基四乙酸, 依地酸
货号：Vetec的V900106
Catalog #: V900106线性分子式 (HO2CCH2)2NCH2CH2N(CH2CO2H)2 分子量 292.24
1.9 NaCl
Sodium chloride
中文名: 氯化钠
货号：Vetec的V900058
Catalog #: V900058 线性分子式 NaCl 分子量 58.44
1.10 DTT
DL-Dithiothreitol
中文名: 二硫苏糖醇
货号：BIOSHARP的???
Catalog #:??? 分子式为C4H10O2S2，分子量为154.25
1.11 Triton X-100
T-octylphenoxypolyethoxyethanol
中文名: 曲拉通 X-100
货号：生工的A110694-0100
Catalog #: A110694-0100 分子式为C34H62O11，密度 1.06 g/ml(25°C)
1.12 MgCl2·6H2O
Magnesium chloride hexahydrate
中文名: 氯化镁 六水合物
货号：Vetec的V900020
Catalog #: V900020 线性分子式 MgCl2·6H2O 分子量为203.20
1.13 dNTP
dNTP mixture, 10 Mm
中文名: dNTP mixture 溶液（10 mM）
货号：生工的B500056
Catalog #: B500056
10 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
2 试剂的配置
2.1 1M Tri-Cl pH 7.5
12.114g Tris base 溶于80ml d2H2O,用HCl调节pH到达7.5。补d2H2O定容到到100mL；
2.2 50mM NAD
0.03317g NAD(4℃保存), 补d2H2O到1 ml，配置好后-20℃保存；
2.3 5×APB (5×Assembly Pre-Buffer)
母液浓度 | 所需母液体积 | 使用浓度 |
1M Tri-Cl pH 7.5 | 0.5ml | 0.5M Tri-Cl pH 7.5 |
each dNTP 10mM | 100ml | 1mM each |
50mM NAD | 100μl | 50mM NAD |
PEG8000 | 250mg | 25% （m/v） |
d2H2O | To 1ml | To 1ml |
配置好后-20℃保存，使用前用涡旋仪振荡。
2.4 1M MgCl2
20.32g MgCl2·6H2O，补d2H2O定容到到100mL；
2.5 1M NaCl
5.844g NaCl，补d2H2O定容到到100mL；
2.6 1M DTT
1.5425g DTT，补d2H2O定容到到10mL；使用前将沉淀混匀；
2.7 0.5M EDTA
14.612 g EDTA，溶于100ml d2H2O,用NaOH调节pH到达8。补d2H2O定容到到100mL;
2.8 T5 Exonuclease Dilution Buffer
母液浓度 | 所需母液体积/μl | 使用浓度 |
100% glycerol | 500 | 50% glycerol |
1M Tri-Cl pH 7.5 | 50 | 50mM Tri-Cl pH 7.5 |
0.5M EDTA | 0.2 | 0.1mM EDTA |
1M DTT | 1 | 1mM DTT |
1M NaCl | 100 | 0.1M NaCl |
Triton X-100 | 10 | 0.1% Triton X-100 (v/v) |
d2H2O | To 1ml | To 1ml |
配置好后-20℃保存；
2.9 T5(1U/μl)
10μl的T5 Exonuclease溶于90μl T5 Exonuclease Dilution Buffer ，配置好后-20℃保存；
2.10 Gibson buffer
母液浓度 | 所需母液体积/μl |
5×APB | 26.67 |
1M DTT | 1.33 |
1M MgCl2 | 1.33 |
Phusion | 1.67 |
T5(1U/μl) | 0.6 |
Taq DNA Ligase | 13.33 |
d2H2O | 55.07μl (To 100μl) |
配置好后分装成1.6μl/管，-20℃保存；其中一次反应只需要1.5μl。
3 Gibson 反应
3.1 Gibson 反应体系
母液 | 所需母液体积/μl |
片段 (A ng/μl) | x |
切好的载体(B ng/μl) | Y |
Gibson buffer | 1.5 |
总体积 | 2.8 |
X+Y=1.3
(A* X)/2= (B* Y)/10
3.2 Gibson 反应程序
50℃，反应45min,反应结束后，直接加入感受态中，或者-20℃保存；
申明
此Gibson buffer配置方式可与各种试剂官网说明书，一起看。文中方法不一定适合所有的克隆，因此仅供参考。
如果有错误，请发送到邮箱1329532528@qq.com ,谢谢！