材料和试剂

1.盖玻片小号，22 × 22毫米（费舍尔小号系统求解，赛默飞小号系统求解，目录号：15727582）
2.显微镜载玻片，Superfrost（VWR，目录号：631-0113）
3.移液器吸头
4.牛小号erum一个lbumin（Sigma-Aldrich公司，目录号：9048-46-8），保存于4 - 8°C
5.驴血清（Sigma-Aldrich，目录号：D9663），储存在-20°C
6.山羊抗人/小鼠髓过氧化物酶抗体（Novus Biologicals，目录号：AF3667），-20°C保存
7.兔抗ħ istone H3（瓜氨酸R2 + R8 + R17）抗体（Abcam公司，目录号：ab5103），储存在-20℃下
8.驴抗克燕麦的IgG（H + L）ħ ighly横一个dsorbed二级抗体的Alexa Fluor488的缀合（赛默飞小号系统求解，目录号：A32814），保存于4 - 8°C
9.驴抗- [R abbit的IgG（H + L）ħ ighly横一个dsorbed二级抗体的Alexa Fluor568的缀合（赛默飞小号系统求解，目录号：A10042），保存于4 - 8°C
10. Neo Clear（Sigma-Aldrich，目录号：64741-65-7）
11.无水乙醇（Fisher C hemical，目录号：E/0600DF/15）
12.的Xyl ë NE（VWR，目录号：28973.363）
13.超纯DN一个SE / RN一个SE- ˚F REE d istilled水（热˚F isher小号系统求解，Invitrogen，目录号：10977049）
14. DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：28718-90-3），储存在-20°C
15.的ProLong ģ老一个ntifade米ountant（赛默飞小号系统求解，目录号：P10144），储存在-20℃下
16.山羊IgG我sotype控制（赛默飞小号系统求解，目录号：31245），保存于4 - 8°C
17.兔的IgG我sotype控制（赛默飞小号系统求解，目录号：31235），保存于4 - 8°C
18.甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：47608）
19. HIER Tris-EDTA 缓冲液，pH 9 。0（10 × ）（Zytomed 系统，目录号：ZUC029-500），储存在 4 - 8°C
20.吐温- 20（费舍尔小号系统求解，Acros Organics公司，目录号：10491081），在室温下储存（RT）
21. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：9002-93-1），在室温（RT）下储存
22.抗原- [R etrieval缓冲液（见配方）
23.透化缓冲液（见配方）
24.阻塞缓冲区（见食谱）

设备

Tissue-Tek-VIP 5（樱花）
旋转切片机（徕卡）
蔡司 LSM 880 Airyscan Elyra s.1。共聚焦显微镜（蔡司）
StainTray 玻片染色系统（Sigma-Aldrich，目录号：Z670146）
卡特尔PMPHellendhal小号泰宁Ĵ芳（赛默飞小号系统求解，˚F isher小号系统求解，目录号：10375681）
便携式小号队小号terilizer（威望医学，2100经典）
移液器
冰箱(4°C)
冷冻室(-20°C)
化学通风柜

软件

ImageJ（版本 15.1n，NIH，https: //imagej.nih.gov/ij/download.html ）
Imaris（7.5.2 版，牛津仪器）
禅黑（蔡司s）

程序

样品采集、固定和石蜡包埋
收集肺死后活组织检查，并在室温下在4%甲醛中固定三个小时。
固定后，嵌入的石蜡切片检查，以下这三个步骤：
脱水：在F ixation剂由乙醇浓度的增加的连续浴消除：在30分钟三次70％乙醇，然后三次，在30分钟内85％乙醇，并在30分钟三次100％乙醇中。
清除：我mmer小号Ë的组织在一个二甲苯浴三次20分钟。
在 59°C 下嵌入液体石蜡中。
注意：这些步骤可以通过像“Tissue-Tek-VIP”这样的自动化仪器来执行。”
使用旋转切片机切割4 μ m 厚的组织切片并放置在Superfrost 载玻片上。

去除石蜡
冲洗的在新清除载玻片两次10分钟。
P花边的在滑动一个100％ë THANOL浴中5分钟。
P花边在滑动一个96％ë THANOL浴中5分钟。
放置在载玻片的80％Ë THANOL浴中5分钟。
P花边在滑动一个70％ë THANOL浴中5分钟。
P花边在滑动一个50％ë THANOL浴中5分钟。
用超纯蒸馏水冲洗 3 次，每次一分钟。
用1 × PBS冲洗。

抗原修复
P花边滑动的垂直，塑料染色齿条和添加抗原修复缓冲液以完全音麦小号Ë的石蜡包埋的样品（约50毫升缓冲液的8 -滑动架）。
填补了用灭菌的蒸馏水适量。
P花边在消毒机架并关闭它。
将灭菌器加热至120 - 135°C ，然后孵育 10 - 15 分钟。
10后- 15分钟，打开盖子，并允许滑动到冷却至RT在工作台上约20分钟。
用 1 × PBS冲洗两次。

透化
音麦小号Ë的在透化缓冲液载玻片2分钟。
用 1 × PBS冲洗两次。

阻塞
放置的在载玻片的染色齿条和孵化在室温用一小时封闭缓冲液。
保持的过量封闭缓冲液在4℃下。
在封闭步骤中，准备 StainTray 玻片染色系统。P花边在托盘湿润的。
冲洗的一次用1滑动× PBS 。

初级染色
准备的主要染色组合。使用80 μ升染色混合物为每1厘米2样品。适应的量染色组合根据表面面积的样本。在封闭缓冲液中以1/40 稀释添加山羊抗 MPO和以1/100 稀释添加兔抗组蛋白 3 。
放置在幻灯片的染色系统托盘。
P蕾丝的混合染色的组织切片完全音麦小号Ë他们。
关闭染色系统并在室温下孵育一小时。
转移的幻灯片的塑料架。
用 1 × PBS冲洗 3 次。

二次染色
准备在二次染色组合。添加抗山羊甲的LexA ˚F在luor 488一个1/200稀释，抗-兔甲的LexA ˚F luor 568在一个1/200稀释，和DAPI在一个1/1 ，000稀释在封闭缓冲液。
放置在幻灯片的染色系统托盘。
地方上混染色的组织切片完全音麦小号Ë他们。
关闭的染色系统，并在室温下孵育2小时。
转移的幻灯片的塑料架。
用 1 × PBS冲洗 3 次。
删除了从染色系统湿润的托盘。
干的幻灯片。
重要提示：ñ曾经触及组织切片。
从此时开始，在工作一个通风橱，以实现最佳的干燥。P花边延长降摹老上到的组织切片，并添加盖玻片。允许的幻灯片，以干通宵，保护从光，但没有完全关闭的染色系统，以促进空气流通。在使用其他封固剂的一些实验中，我们观察到 Cit-H3 染色迅速消失。由于 ProLong G old 被描述为保护荧光染料免于褪色和光漂白，因此我们选择了这种安装介质。
分析的幻灯片和采集图像使用在两天内共聚焦显微镜的染色。

控件
您可以执行两种类型的阴性对照。您可以使用同种型对照抗体进行初步染色，即山羊 IgG 和兔 IgG 同种型对照抗体，而不是类似浓度的抗 MPO 和抗瓜氨酸组蛋白 3。或者，您可以用与产生一抗的宿主物种（即兔和山羊血清）的血清一起孵育来代替初级染色。在这两种情况下，二次染色保持不变。

数据分析

图像采集
使用共聚焦显微镜（此处为蔡司 LSM 880）获取图像。选择合适的激光器；在这种情况下，为488nm（MPO），561纳米（Ç它-H3 ），和405nm（DAPI）。调整所述激光的电压，以确定染色结构。为确保染色的特异性，请将阳性样品与对照样品进行比较。一旦该激光器已经建立，一定要分析和比较总是使用相同的设置所有的幻灯片。母语被鉴定为细胞外结构即染色阳性的MPO和Cit-H3。DAPI 染色并不总是在 NETs 中观察到，因为 NETs 由去浓缩的染色质组成（图 1）。为了进一步孔定量泰特的母语，我们进行Z堆叠采集6 - 10在随机视野中每部分20 ×放大率。

图1.肺 NETs 的代表性图像。母语被鉴定为细胞外结构，其中MPO（AF-488，绿色）和Cit-H3（AF568，红色）CO -局部化（白色箭头示出）。合作-本土化与DAPI不能总是被观察到。图像是在20倍放大率下获得的。比例尺s ，10 µm。

Q uanti牛逼净容积的通货膨胀
到孔定量泰特在肺组织切片的蚊帐（图2），我们分析了6 - 10 （20 ×每部分放大倍数），以及每一个病人部（RADERMECKER等人，2020）。我们取得的Z堆叠图像我们荷兰国际集团在了Imaris软件。我们进行结构的三维重建该染色编双-阳性CIT-H3（红色）和MPO（绿色）（图2），并提供了Imaris孔定量吨通货膨胀这些结构的体积。共定位方法使用三个 Imaris 脚本/宏工具（表 1）。第一个脚本处理的文件夹中的所有文件.ims ，T母鸡阈值红色CIT-H3和绿色MPO染色。在此步骤中，我们使用d阈值将体素与背景分开，并将体素与染色分开，在每个单独的通道中。我们将真染色定义为超过 10 个体素的所有染色。然后，阈值方法顶替ð图像中的每个像素与黑像素，如果所述图像强度是小于先前固定（10分体素）的阈值，或白像素，如果所述图像强度是大于阈值。接着，我们创建了一个新的信道，即，之间的交点的红色和绿色的阈小号，其中所有的体素具有共-定位等于1的第二脚本然后测得的红色和绿色的阈值之间的交叉点的体积小号. 最后，第三个脚本测量图像的总体积并创建一个包含所有测量值的 Excel .xlsx 文件。最后，我们划分ð体积得到的（体积的红色和绿色通道相交小号通过肺组织的总体积）进行分析各样品中，以得到的立方微米小号每立方微米的肺组织的网。所有的程序为孔定量吨通货膨胀在图3中表示。

图2.体积的3D 构造示例，其中存在 MPO 和 Cit-H3 的共定位。Cit-H3+MPO+ NETs 的共聚焦显微镜染色（左）和三维建模（右）。比例尺s ，10 µm。

图3 。程序用于3D重建体积的，其中共- MPO和Cit-H3的定位存在于了Imaris 。1)添加新的红色表面；2）我nitiat È ; 3）ç hoose的红色通道，平滑0.2，绝对强度; 4）小号等的阈值，以1280; 5)将表面分类为10 以上；6）V alidate表面上; 7）- [R EPEAT步骤小号2 - 6的绿色通道; 8）选择通道绿色>切>屏蔽所有>通道1和重复所述施加掩模>恒定以外为0之前通道; 9）重复步骤小号2 - 6的掩码红色通道。

用于孔定量表1.脚本吨NET体积的通货膨胀

统计分析
我们代表艾德数据的平均值为每个板块和使用分析它的统计学意义一个非-参数Mann - w ^ ^ h itney U检验上的平均值。P值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

笔记

而吨他当前协议已经主要采用在人肺福尔马林-固定的石蜡包埋（FFPE）的部分，它也被应用到人肝，胰腺，肾，（RADERMECKER和心脏FFPE切片。等人，2020）。虽然我们没有发现严重的Covid-19的患者这些机构网结构，既没有我们发现非特异性染色，这表明该协议还可以应用到这些器官。
值得注意的是，MPO 也可以被其他吞噬细胞表达，例如人巨噬细胞或嗜酸性粒细胞，它们也可能形成细胞外陷阱并染色 Cit-H3 ；吨herefore中，如果附加的污渍针对嗜中性粒细胞标志物，如Ly的-6G中，w本协议会更具体为嗜中性粒细胞和渔网作为使用。根据我们的经验，抗-LY-6G抗体不正确的FFPE切片工作，有的还克隆检测Ly的-6C，这不利于对SOLV Ë特异性问题。在实验室小鼠中，中性粒细胞的选择性消耗，例如抗 Ly-6G 介导的消耗，可用于确认该方法的特异性，如前所述（Radermecker等，2019）。实际上，网被小号hown存在于嗜中性粒细胞从充足的小鼠鼻内暴露于脂多糖低剂量的肺，但网被嗜中性粒细胞耗尽的小鼠中不存在（RADERMECKER等人，2019）。

食谱

1.抗原- [R etrieval缓冲
用蒸馏水将HIER Tris-EDTA 缓冲液 pH 9.0 (10 × )稀释 1/10 。添加 Tween - 20，最终浓度为 0 。05%。
2.透化缓冲液
将 Triton X-100 添加到PBS 中，最终浓度为 0.5%。
3.阻塞缓冲区
添加BSA在2％的终浓度，并驴血清在2％在PBS中的终浓度。

致谢

免疫荧光协议被从物品适于由图桑和科尔一客串（图森等人，2017 ）。所述孔定量吨通货膨胀方法是在RADERMECKER描述等。（2019 年和2020 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

使用人体标本是由伦理在2020年批准了小号列日大学医院（REF一百十九分之二千零二十）的审查委员会。

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