材料和试剂

1. 1.5 ml 微量离心管（Rikaken，目录号：RSV-MTT1.5）
2.移液管，3 ml（Falcon，目录号：357575）
3. 8条管，圆顶型（Rikaken，目录号：RS-PCR-8D）
4.细胞培养皿，100 mm（Nippon Genetics，目录号：FG-2090）
5.细胞培养皿，35 mm（Nippon Genetics，目录号：TR4000）
6. Gemma Micro ZF 75 (Skretting)
7.乙姬B2 （丸红日清饲料）
8. Kimwipe (金伯利克拉克)
9.用于核酸结合的 AcroPrep Advance 96 孔长尖过滤板（Pall，目录号：8133）
10. AcroPrep Advance 的储液器（默克，目录号：BR701340-50EA ）
11. Eppendorf twin.tec 96孔 LoBind PCR 板（Eppendorf，目录号：0030129512）
12.带分隔器的DuraCross斑马鱼养殖箱（实验室产品销售，目录号：T233795）
13. Zebraifsh ( Danio rerio )
14. TRI Reagent-LS（分子研究中心，目录号：TS120）
注意小号：
也可以使用 TRIzol-LS 试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：10296028）或 ISOGEN-LS（Nippon Gene，目录号：311-02621）。
Sepasol-RNA II Super（Nacalai Tesque，目录号：30487-46），一种等效产品，不能用于从成年斑马鱼中提取 RNA，因为在冷冻和粉碎过程中会产生沉淀物。
15.乙醇，99.5%（Nacalai Tesque，目录号：08948-25）
16.无核酸酶水（默克，目录号：H20MB1006）
17. BioMasher II（Nippi，目录号：320102；图1）

图 1. BioMasher II 图像

18.液氮
19. Pronase（默克，目录号：53702）
20. QuantiFluor RNA系统（Promega，目录号：E3310）
21. Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒（Agilent Technologies，目录号：5067-1513）
22. 10 ×上样缓冲液（Takara Bio，目录号：9157）
23. ExcelBand 1 KB（0.25 - 10 kb）DNA Ladder（Smobio，目录号：DM3100）
24. Tricaine（Wako，目录号：051-06571）
25.三（羟甲基）氨基甲烷（Rikaken，目录号：RSP-THA500G）
26.硼酸（Wako，目录号：021-02195）
27. EDTA-2Na（Wako，目录号：343-01861）
28.琼脂糖粉（Rikaken，目录号：RSV-AGRP-500G）
29. 10毫克/毫升的Et ħ idium溴化物（日本基因，目录号：315-90051）
30.乙醇，80%（见食谱）
31. 1％一garose凝胶（见配方）
32. Tricaine（见食谱）
33. E3 培养基（见配方）
34. 20 毫克/毫升链霉蛋白酶（见食谱）
35. 5 × TBE （见ř ecipes）

设备

研钵和研杵，120 mm（AsOne，目录号：6-549-03）
Vortex-Genie 2（科学工业）
PlateSpin II（久保田）
Quantus 荧光计（Promega，目录号：E6150）
Agilent 2100 生物分析仪系统（安捷伦，目录号：G2939B）

程序

斑马鱼维护和幼虫收集
在28.5保持在再循环系统成年斑马鱼℃下根据黑暗周期：下14:10小时光照的标准协议（韦斯特，2000年）。
将雌性和雄性成年斑马鱼放入带有分隔鱼的分隔器中，以避免立即交配。
第二天早上取下隔板，获得受精卵[胚胎，受精后 0 天 (dpf) ] 。
在 28.5 °C的 100 毫米细胞培养皿中，在 E3 培养基中培养斑马鱼胚胎。
在 1 dpf 时，将含有 2.5 ml E3 培养基的胚胎转移到 35 mm 细胞培养皿中，并添加 150 μ升20毫克/毫升的链霉蛋白酶。
在室温 (RT) 下孵育 15 分钟后，通过搅拌培养皿来去除胚胎。
将胚胎转移到 100 毫米的细胞培养皿中，加入 20 毫升 E3 培养基，并在 28.5 °C 下将它们培养至 5 dpf 。
将斑马鱼幼虫 (5 dpf 幼虫) 放入循环系统 (30 条幼虫/水箱)。
饲料斑马鱼的循环系统都草履虫和杰玛微ZF 75，一天两次从5到30 DPF。
进料幼体（30 - 90单丝旦）和成人（〜90单丝旦）既盐水虾和Otohime B2一天两次后30单丝旦（若松。等人，2019）。

从斑马鱼幼虫和幼鱼中提取 RNA
注意：在所有 RNA 提取步骤中使用无核酸酶提示。
幼虫（大约4-12 dpf，尺寸小于 5 毫米）
一种。将斑马鱼幼虫在 20 毫升 0.2 毫克/毫升 Tricaine 中在 RT 中麻醉 3 分钟。
湾制备100 μ升的以8条管TRI试剂-LS。
C。将单个斑马鱼幼虫放入 8 条管的盖子内，并使用微量移液器去除水分（图 2）。

图2 。斑马鱼放置在吨的腹腔8条管圆顶帽

d. 将盖子组装到 8 条管上，每口井都含有 TRI 试剂，并通过在室温下涡旋1 分钟来完全裂解幼虫。
e. 立即进行 RNA 纯化步骤或将 100 μl裂解物在 -80 °C 下储存1 个月。
幼虫（大约 14 - 38 dpf，尺寸小于 10 毫米）
一种。将斑马鱼幼虫在 20 毫升 0.2 毫克/毫升 Tricaine 中在 RT 中麻醉 3 分钟。
湾使用 Biomasher II 将斑马鱼幼虫转移到 1.5 ml 微量离心管中，并使用微量移液器去除多余的水。
C。添加50 μ升的TRI试剂-LS的幼虫，并立即捣碎在RT使用研杵直到它被完全破碎。
d. 添加50 μ升的TRI试剂-LS和v ortex样品1分钟在室温。
e. 立即进行 RNA 纯化步骤或将 100 μl裂解物在 -80 °C 下储存1 个月。
少年（约38 dpf，尺寸大于 10 毫米）
一种。将斑马鱼幼鱼在 20 毫升 0.2 毫克/毫升 Tricaine 中在 RT 中麻醉 3 分钟。
湾将幼年斑马鱼放入 120 毫米的研钵中，并使用 Kimwipes 擦拭幼鱼以除去水分。
C。倒入液氮快速冷冻幼体。
d. 使用杵将冷冻的幼鱼研磨成粉末（图 3）。

图3.关于GRI研钵少年斑马鱼的图像Ñ丁

e. 将 1 ml TRI Reagent-LS 添加到冷冻粉末中并使用研杵混合直至混合物变成液体。
注意：TRI Reagent-LS 在组织裂解完成前被冷冻。要完全溶解组织，解冻试剂是必不可少的。放置砂浆在水浴（40 - 50 ℃下）为sufficie Ñ吨到除霜试剂在较短的时间。的完整性的RNA不受这种变暖。
F。转移100 μ裂解物升至EW 1.5 ml离心管。
G。立即进行 RNA 纯化步骤或将 100 μl裂解物在 -80 °C 下储存1 个月。
注意：要重复使用，应用蒸馏水清洗砂浆，直到完全去除裂解物。
RNA纯化
向 100 μl裂解物中加入 100 μl 99.5% 乙醇，并在室温下涡旋混合。
注意：当在裂解物被储存在-80 ℃下在该步骤之前，解冻它在室温。
在储液器上准备 AcroPrep Advance 96 孔滤板（图 4）。

图 4.储液器上的 AcroPrep Advance 96 孔滤板

将 200 μl混合物转移到 AcroPrep Advance 板的每个孔中。
在室温下以 1,300 × g离心4 分钟。丢弃流通。
添加400 μ升的99.5 ％的乙醇和在1,300离心板×克在室温下4分钟。丢弃流通。
重复加入400 μ升的99.5 ％的乙醇和在1,300离心板×克在室温下4分钟。丢弃流通。
加入700 μ升80％的乙醇于板和离心机在1300 ×克，在室温10分钟。丢弃流通。
洗脱通过添加30所述RNA μ升的无核酸酶的水到每个的中心孔中，接着我ncubation在RT 1分钟。然后，在室温下以 1,300 × g离心4 分钟。RNA 溶液可以储存在 -80 °C 。

RNA浓度的测定
根据制造商的手册，使用 QuantiFluor RNA 系统试剂盒和 Quantus 荧光计确定 RNA 浓度。典型结果如注1所示。
注意：Ť他预期来自个体RNA浓度太低而不能使用分光光度计（例如，纳米滴）来测定。

RNA质量检查
我们建议您检查通过琼脂糖凝胶电泳或RNA的质量与生物分析仪的一些但不是所有的样品，因为RNA的量，在某些情况下低。
琼脂糖凝胶电泳
一种。添加15 μ升（300毫微克/泳道）的RNA样品的成1％琼脂糖凝胶的孔中。
湾在 0.5 × TBE 中以 135 V 运行电泳 25 分钟。典型结果如注2所示。
生物分析仪
此过程需要使用生物分析仪。
根据制造商手册，使用 Agilent 2100 生物分析仪和 Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒检查 RNA 质量。典型结果如注3所示。

笔记

用于RNA分离使用直接-TRI和苯酚的产率典型-氯仿示于表1中。由于在限制RNA的能力，结合至AcroPrep超前96过滤板（大约3 μ克）时，指示按产量当使用成年斑马鱼时，TRI 往往比苯酚-氯仿方法（Peterson等，2009）小。

表 1.使用 Direct-TRI 和苯酚-氯仿方法获得的总 RNA 量

通过电泳进行 RNA 质量检查的典型结果如图 2 所示。使用TRI Reagent-LS以斑马鱼 (6 dpf) 提取 RNA ，比较两种不同的 RNA 提取方法，然后检查 RNA 质量。两个主要条带（28S 和 18S rRNA）表明 RNA 没有降解（图 5）。使用 Direct-TRI 方法成功获得了小分子 RNA，但使用传统的苯酚-氯仿法则无法获得。

图5 。通过琼脂糖电泳检测 RNA 质量的典型结果

RNA的质量检查的一个典型的结果使用的生物分析仪在图6中示出的RNA是从分离使用Direct-TRI 15单丝旦幼虫，和RNA的质量与检查的生物分析仪。两个RNA峰（18S和28S rRNA的）清楚地观察到，表明该RNA没有降解（RIN 9.10）。在 Direct-TRI 方法中，RIN 值约为 7 - 9.5。

图6 。使用生物分析仪进行 RNA质量检查的典型结果

食谱

E3 中号
5 0× E3 原液
氯化钠 14.65 克（500 毫米）
氯化钾 0.63 克（17 毫米）
氯化钙2· 2H 2 O 2.43 g (33 mM)
MgSO 4 · 7H 2 O 4.07 g (33 mM)
高达 1 L 的蒸馏水
调节pH至7.2以〜100 μ 0.1升1M的NaOH
共 1 升
高压灭菌器 121°C 20 分钟
存储在 RT

E3培养基（1 × E3工作液）
50 × E3 原液 20 毫升
高达 1 L 的蒸馏水
共 1 升
存储在 RT
20 毫克/毫升 Pronas e
链霉蛋白酶 1 克
蒸馏水最多 50 毫升
共 50 毫升
分成 1 ml 等分试样
储存在-20 °C
Tricaine（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸乙酯）
10 mg/ml Tricaine（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸乙酯）
三卡因 1 克
蒸馏水最多 100 毫升
总计 100 毫升
分成 1 ml 等分试样
储存在-20 °C

0.2 mg/ml Tricaine（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸乙酯）
10 毫克/毫升三卡因 1 毫升
蒸馏水最多 50 毫升
共 50 毫升
80% 乙醇
乙醇，99.5% 40 毫升
无核酸酶水 10 毫升
共 50 毫升
存储在 RT
5 × TBE
三（羟甲基）氨基甲烷54.0 克
硼酸27.5 克
EDTA-2Na 1.85 克
高达 1 L 的蒸馏水
共 1 升
存储在 RT
1％一garose凝胶
5 × TBE 35 毫升
琼脂糖粉 3.5 克
蒸馏水 315 毫升
总计 350 毫升
在 121 °C 下高压灭菌1 分钟，然后冷却至 50 °C
添加17.5 μ 10毫克/毫升的升的Et ħ idium溴化物，倒入凝胶板

致谢

我们感谢平田实验室成员的鱼类护理。，武田科学基金会：这项工作是由KAKENHI（19H03329格兰特在急救从文部科学省，日本科研B）的支持，以及内藤基金会。该协议是我们之前工作（Maeta等人，2020）中使用的协议的更新版本。

利益争夺

没有宣布竞争利益。

伦理

本研究经青山学院大学动物护理和使用委员会 (A9/2020) 批准，并根据青山学院大学动物护理和使用指南和体内实验动物研究(ARRIVE) 指南进行。

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