材料和试剂

1. Superfrost 显微镜载玻片（ThermoScientic，Menzel-Gläser，Superfrost Plus，目录号：J1800AMNZ），在室温下储存。充电幻灯片的使用是必要的，以确保适当的琼脂糖附着在幻灯片和以尽量减少处理过程中样品损失
2.矩形盖玻片（盖玻片 22 × 50毫米；ThermoScientic，Menzel-Gläser，目录号：MA062210），在室温下储存
3. 24孔细胞培养板（TPP，目录号：92024），室温保存
4. 15 ml F alcon 管（Greiner，目录号：188271 Zentrifugenröhrchen 15 ml，生产商：Huberlab AG，目录号：7.188 271），室温储存
5.胰蛋白酶 10 ×储备液（Gibco，目录号：15090-046），储备液储存在-20°C。在 1 × PBS 中按1:10 稀释作为工作溶液；这在 4°C 下可稳定数周
6.氯化钾（KCl）（默克，目录号：1.04936.1000），室温储存
7.正常熔点琼脂糖（Standard Agarose-Type LE ；BioConcept，目录号：7-01P02-R ），室温保存
8.低熔点琼脂糖（Low Melt Agarose 100 g ; Bio & Sell，目录号：BS20.47.100），室温保存
9. Na 2 HPO 4 · 7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：S9390-1Kg），室温储存
10. KH 2 PO 4 （Sigma，目录号：602187），室温储存
11. NaCl（Sigma，目录号：71380-1KG），室温储存
12. EDTA二钠盐二水合物（C 10 ħ 14 Ñ 2的Na 2 ö 8 ·2H 2 O）（Sigma-Aldrich公司，目录号：03685-1KG），保存于室温下
13. Tris base（Sigma，Life science，目录号：T1503-500G），室温储存
14.氢氧化钠颗粒（NaOH）（Merck，目录号：1.06498.100），在室温下储存
15. DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D5879-1L），室温储存
16. Triton X-100（MP-biomedicals/LLC，目录号：807426），室温储存
17. SYBR Gold 核酸凝胶染色剂（Life Technologies，目录号：S11494），等分并避光储存于 -20°C
18. 30％ħ ydrogen过氧化物（H 2 ö 2 ）（罗斯，目录号：8070.2），保存于4℃下
19.甲磺酸甲酯（MMS）（Sigma，目录号：129925），在无菌dH 2 O中制成10 M溶液，等分并储存在-20°C
20.裂解缓冲液对所述的碱性彗星试验（见配方）
21.电泳缓冲液为在碱性彗星试验（见配方）
22.彗星染色液（见配方）
23. PBS（磷酸盐-缓冲盐水）（见配方）

设备

Trevigen CometAssay ESII装置（Trevigen，目录号：4250-050-ES）
Fluorescen CE能够激发的显微镜在470 - 530nm至图像SYBR -金（激发最大值495nm左右，发射约537纳米。）
水浴帽能够的保持在37℃的恒定温度和大到足以容纳一个250 -毫升玻璃瓶
大的泡沫聚苯乙烯盒或类似物，大到足以在冰上放置 10-12 个彗星滑梯的玻璃板
小机械师等级
染色缸能的保持荷兰国际集团5个或10滑动
“ ħ UMI d室”由用塑料盒的一个盖，大到足以容纳在湿纸巾10-12载玻片和在37℃下被放置在温箱中

软件

斐济图像处理包（https://imagej.net/Fiji）
斐济的 OpenComet 插件 ( http://www.cometbio.org/ ) (Gyori et al. , 2014)

程序

琼脂糖涂层载玻片的制备（测定前一天或更早）
通过在微波炉中的玻璃瓶中加热，将 1 g 正常熔点琼脂糖完全溶解在 100 ml dH 2 O （1% 溶液）中。确保将盖子松散地放在瓶子上，并注意防止沸腾。
吸取1毫升琼脂糖溶液到的Superfrost滑动，覆盖用盖玻片以均匀地散布在整个滑动，并允许琼脂糖至在室温下集。琼脂糖涂层的厚度将是大约1mm ，并用盖玻片覆盖有助于distribut的离子穿过滑动琼脂糖均匀。
当琼脂糖已成立，轻轻取出的通过使其滑动朝向滑动的短端盖玻片; 将载玻片风干过夜。
当所述滑动已经完全干燥，它们可以直接使用或贮存在阴凉干燥空间几个月。
注：P重新涂覆小号与正常低熔点琼脂糖增加含有彗星分析细胞中的琼脂糖层的粘附大环内酯类。

培养感兴趣的细胞
确保是你感兴趣的细胞在培养和成长指数级。分裂细胞在运行试验前1-3天，根据已建立的细胞培养过程，在所选的媒体中。

在检测当天准备材料
制备所述碱性慧星裂解缓冲液的适当量和冷却至4℃。确保有足够的冷 dH 2 O 来新鲜制备冷电泳缓冲液。裂解缓冲液的所需要的量取决于卷和上的将被用于染色缸的数量。通常，一个中等大小的科普林罐可以容纳 10 张载玻片，需要大约 150 毫升的缓冲液。所需的电泳缓冲液量取决于所使用的设备。对于此处使用的 CometAssay ESII 装置，计算大约。850 毫升。此数量不取决于幻灯片的数量，因为幻灯片的空白空间将被虚拟幻灯片填充。
放置彗星电泳装置（包括所述冷却组）在4℃下冷却下来。
将水浴加热至 37°C。
完全在50ml溶解0.5克低熔点琼脂糖（LMP）1 × PBS （1％溶液;将需要每个样品1毫升加一些额外的;增加的，如果更多的样本将被处理体积）通过加热在玻璃瓶中微波。确保盖好只是松散的瓶子，是心灵FUL的沸点迟缓。完全溶解后，将瓶子放入 37°C 水浴中以达到平衡。
注：ķ eeping的热水浴正确的温度是必不可少的-如果太冷，琼脂糖将小号olidify; 如果太热，这将对细胞造成额外的损害。
使用铅笔标记琼脂糖涂层的幻灯片。确保以制备至少一式两份，一式三份地更好，幻灯片每个测定条件（例如，时间点或量DNA的-损伤剂）。
准备您的工作场所（见图 2）：

˚F igure 2 。进行彗星试验的工作场所的拟议布局。文中讨论的材料的最佳排列。

填充一个大的小号tyrofoam桶冰块，放在玻璃板水平上冰的顶部，并检查使用水平，保证了细胞的琼脂糖将整个滑动平均分布。
将装有冷裂解缓冲液的coplin 罐放入同一个桶中（或旁边的另一个装有冰的桶）。
将一个空的24 孔板放入第二个冰桶中，准备接收细胞悬浮液。
在 37°C 水浴旁边准备好以下材料：P100 或 P200 移液管加吸头、P1000 移液管加吸头、在 37° C平衡的熔融低熔点琼脂糖、标记的显微镜载玻片、盖玻片和计时器。

细胞处理和琼脂糖包埋
根据不同的研究的问题，碱性彗星测定可用于评估DNA DAMA的量GE引起的快速和直接的特定量-作用DNA -损伤剂，诸如ħ 2 ö 2 （参见步骤d 1），或通过DNA - ，需要较长的温育时间段或在细胞中的代谢活化，诸如MMS损伤剂（见步骤D2）。此外，彗星实验，可被利用来评估重新暴露于后一对动力学一个一定量的DNA的-损伤剂（见步骤D3），也是在细胞（内源存在的DNA损伤的水平例如，由于遗传消融的的DNA修复途径）（见步骤D4）。
用H处理细胞2 ö 2作为所述DNA -损伤剂，以确定引起DNA损伤的程度。
胰蛋白酶化指数生长的细胞，中和的由胰蛋白酶的加入完全培养基中，该计数细胞，并稀释至2 × 10 5个细胞/ ml在选择的完全培养基中在15 -毫升˚F爱尔康管。
将在˚F冰上爱尔康管用于从细胞培养实验室转移到工作台上。
为了确保即使悬浮液的细胞，小心地反转的˚F爱尔康管几次（避免形成泡沫或剧烈为了不损坏电池的摇动）和然后移液管将250μl细胞悬液到24孔平板的孔中（1每个载玻片/样品都很好）保存在冰上。
稀贵DNA -破坏阿根的利益T，例如，^ h 2 Ø 2采用串行diluti，至所需浓度，如果你想用30μMH至处理细胞：附件如下2 Ø 2 ，准备ñ 11 ×治疗解决方案330 µM H 2 O 2 。将 25 µl 该溶液与 250 µl 细胞悬液混合；因此，您需要制备 11 ×处理溶液以获得 1 ×终浓度。对于一个连续稀释的一个例子，以获得3.3毫米，1.1毫米的处理溶液，和330μMħ 2 ö 2 ，其转化为300μM，100μM ，和30μM最终ħ 2 Ó 2在测定中，请参阅图3 。确保包括一个加入PBS只有在细胞对照治疗。

图3.连续稀释示例。按照概述的稀释步骤，以获得3.3毫米，1.1毫米的处理溶液，和330μMħ 2 ö 2从H的9.8米库存开始2 Ò 2 。

启动定时器计数；在30级小号，添加25 μ升所需ħ 2 ö 2由第一井（起始处理液例如，顶部左侧）24孔板并轻轻摇动该板均匀分布; 与孔粘附到的其余部分重复这个30 -的时间间隔（1个孔被处理的每30个小号），如在图中概述4。
注：牛逼，他治疗的时间间隔可以缩短到20或15秒，但是这需要实验者一些练习。根据我们的经验，15 s 是仍然可以准确处理的最短间隔。当附着于这样的短的总培养时间为这里（5分钟）建议，可以在从一个单一的“运行”被处理的样本的数目的开始的处理以裂解由限制选择时间间隔。如果样品需要被划分成不同的“运行”后直接彼此具有相同的细胞和试剂进行，确保所有处理条件组的一个复制到相同的组（即，分组控制复制1，治疗阿复制1，治疗乙复制1，...等。在一起），而不是细分不同吨reatment条件中，为了保持相等的条件下，以不同的组中的不同的治疗组。虽然我们还没有观察到运行之间的强批次的影响，我们不能排除会有变化是使其不适宜直接比较不同样本的运行没有“normali ž ING”，以一个内置的参考样本。

图4.样品organi的实施例ž在一个24孔板通货膨胀为H的滴定2 Ò 2 。启动定时器后，加25 μ升所需ħ 2 ö 2处理液至孔中每30秒，如图所示。

治疗最后的后良好，得到冰桶准备与玻璃板并确保它仍然是水平的; 拿到 P1000 和盖玻片，打开低熔点琼脂糖瓶（仍在 37°C 水浴中）。
后恰好5分钟（当计时器显示05:30分钟），停止第一ħ 2 ö 2通过加入1ml LMP-治疗一个garose到阱，小心地吸移，以避免强气泡形成。A吸出混合物并将 1 ml 细胞琼脂糖混合物转移到适当的琼脂糖包被的显微镜e载玻片上。立即用盖玻片覆盖，注意保持幻灯片尽可能水平，将其转移到冰上的冷玻璃板上，让琼脂糖沉淀。重复此为每口井，秉承30 -秒的间隔，直到所有的细胞样本已经被转移到载玻片上。这个过程可以visuali ž版在视频1。

视频1.将细胞嵌入琼脂糖

当所有样品都转移到载玻片上并且琼脂糖凝固后，沿着其纵轴（从第一个样品开始）滑动盖玻片，轻轻取出每个盖玻片，然后将载玻片浸入coplin jar中的裂解缓冲液中。将样品保存在冷（冰上）裂解缓冲液中至少 1 小时，避光。如果样品始终保持在 4°C 并避光，该步骤可以延长至过夜孵育。
与MMS细胞作为治疗的一个DNA -损伤剂，以确定DNA损伤的程度。
种子指数生长的细胞ö n要一个24孔板，以获得约 2 × 10 5 个细胞/孔，24 小时后。
24接种后H，稀贵DNA -的利益损伤试剂，例如，MMS，在寒冷的完全培养基所需的浓度。您需要 1 毫升溶液/孔加上一点额外的。
要处理细胞，请通过抽吸或倒置培养板除去正常培养基，然后将 1 ml MMS 溶液加入相应的孔中。确保包括没有 MMS的介质的控制处理。
孵育在37℃的板对在规定的时间，例如，60分钟。
收获的细胞，洗净各孔用PBS ，除去该PBS ，并添加50μl的胰蛋白酶溶液，以每孔中。将培养板在37℃，定期检查是否在细胞分离。一旦所述细胞已经从底部分离时，中和的通过添加200微升冰冷却的完全培养基中胰蛋白酶和立即将板在冰上。
向孔中加入 1 ml 37°C LMP - a琼脂糖，将细胞包埋在琼脂糖中，小心移液以避免形成强烈气泡。A吸出混合物并将 1 ml 细胞琼脂糖混合物转移到适当的琼脂糖涂层显微镜e载玻片上。立即用盖玻片覆盖，注意保持幻灯片尽可能水平，转移到冰上的冷玻璃板上，让琼脂糖沉淀。对每个孔重复此操作，直到所有细胞样本都转移到载玻片上。
当所有样品都转移到载玻片上后，沿其纵轴（从第一个样品开始）滑动盖玻片，轻轻取出盖玻片，然后将载玻片浸入coplin jar中的裂解缓冲液中。将样品保存在冷裂解缓冲液（冰上）中至少 1 小时，避光。此步骤可以延长至过夜孵育，前提是样品始终保持在最大温度。4°C 避光。
评估曝光后彪修复动力学的至H 2 ö 2作为所述DNA -损伤剂。
确保该培养箱正在运行，并且放置“湿室”内平衡至37℃。
准备在细胞中列出的步骤D1A-D1D 。
胰蛋白酶化指数生长的细胞，NEUT ralize的由胰蛋白酶的加入完全培养基，计数的细胞，并稀释至2 × 10 5个细胞/ ml在完全培养基中的选择在15 -毫升˚F爱尔康管。
将在˚F爱尔康冰上管用于从细胞培养实验室转移到工作台上。
为了确保一个细胞甚至悬浮液，小心地反转第ë ˚F爱尔康管几次（避免形成泡沫或剧烈为了不损坏电池的摇动）和然后移液管将250μl细胞悬液到24孔平板的孔中（每个载玻片/样品 1 孔）保存在冰上。
稀贵DNA -感兴趣损伤剂，例如，ħ 2 Ò 2 ，至所需浓度如下：如果要治疗的细胞与30μM的ħ 2 ö 2 ，制备Ñ 11 × 330μM的治疗溶液H 2 ○ 2 。25 µl 溶液将与 250 µl 细胞悬液混合；因此，您需要制备 11 ×原液以获得 1 ×终浓度。在准备储备溶液时，考虑您需要处理的孔数以获得动力学的所有时间点。
注意：Ť o确保由治疗产生的DNA损伤的量是一种生理范围内，并且可以被细胞正确地修复，选择损伤剂的浓度，在产生大约30-35％的DNA的尾巴的平均值. 对于初级人成纤维细胞，这通常为约25 - 30μMħ 2 ö 2以下的时描述的过程。
启动定时器计数；立即（在0小号）添加25 μ升ħ 2 ö 2处理液的第一孔（例如，在24孔板的顶部左侧），并轻轻摇动板均匀分布; 与孔粘附到的其余部分重复这个30 -的时间间隔（1个孔被每30个处理的小号），如图5所概述甲DD仅PBS吨ö的最后两个孔作为对照处理。
注：牛逼，他治疗的时间间隔可以缩短到20或15秒，但是这需要实验者一些练习。根据我们的经验，15 s 是仍然可以准确处理的最短间隔。

FIGUR Ë5.样品organi的实施例ž在一个24孔板通货膨胀当细胞治疗用H 2 ö 2曝光后，以评估动力学修复的DNA -损伤剂。启动定时器后，加入25 μ升所需ħ 2 ö 2处理溶液（例如，30 μ M）到W厄尔每30秒，如图所示。甲DD仅PBS吨ö的最后两个孔作为对照处理。维修时间是指分钟该样品将在37℃下孵育DNA修复它们在琼脂糖上的幻灯片嵌入后发生。

处理最后一个孔后，得到冰桶准备与玻璃板并确保认为它仍然是水平。ģ等的P1000和盖玻片并打开低（在37℃水浴中仍然）低熔点琼脂糖瓶。
后恰好5分钟（当计时器显示5时分钟），停止第一ħ 2 ö 2通过加入1ml LMP-治疗一个garose到阱，小心地吸移，以避免强气泡形成。A吸出混合物并将 1 ml 细胞琼脂糖混合物转移到适当的琼脂糖包被的显微镜e载玻片上。立即用盖玻片覆盖，注意保持幻灯片尽可能水平，将幻灯片转移到冰上的冷玻璃板上，让琼脂糖沉淀。重复此为每个WEL L，秉承30 -秒的间隔，直到所有的细胞样本已被转移到载玻片上。值得注意的是，损伤剂没有在此设置中删除，但简单地用完全培养基，其还用于neutrali稀释ž ë ħ 2 ö 2非常迅速并最小化任何额外的破坏作用。如果另一类型的damagi使用纳克剂，其需要被冲走，请坚持用于MMS协议（步骤d 2）用于治疗/嵌入到琼脂糖。
当您的所有样品都包埋在载玻片上的琼脂糖中后，将冰块放入37°C 的培养箱中。移动至15分钟，30分钟，并进入潮湿箱中60分钟修复滑动培养箱中DNA修复发生。在 0 计数时重新启动计时器。
注意：通常情况下，治疗原发性成纤维细胞与30 μ中号ħ 2 ö 2 5个分钟会导致DNA损伤的中等水平（即，在大约30％的DNA的尾部），发生和大部分损伤的修复预期而快速前30内- 60分钟（对于示例，请参见帕尔斯组件等人。，2009）。
对于控制和 0 分钟时间点，通过沿其纵轴滑动盖玻片并将其浸入 coplin 罐中的裂解缓冲液中，轻轻地从载玻片上取下盖玻片。将样品保存在冷裂解缓冲液中（冰上）。
在15分钟，得到了两个幻灯片从孵化器15分钟修复，去除盖玻片，沉浸在裂解缓冲保护版的光。对 30 分钟和 60 分钟的时间点重复此操作。
当所有的幻灯片是在裂解缓冲液，用电泳，然后再继续温育样品至少1小时。此步骤可以延长至过夜孵育，前提是样品始终保持在最大温度。4°C 避光。
评估培养细胞中的内源性 DNA 损伤。
胰蛋白酶化指数生长的细胞（对照与例如，KO细胞），中和的由胰蛋白酶的加入完全培养基，计数的细胞，并稀释至2 × 10 5个细胞/ ml在完全培养基中的选择在15 -毫升˚F爱尔康管.
将在˚F冰上爱尔康管用于从细胞培养实验室转移到工作台上。
为了确保一个细胞甚至悬浮液，小心地反转的˚F爱尔康管几次（避免形成泡沫或剧烈为了不损坏电池的摇动）和然后移液管将250μl细胞悬液到24孔平板的孔中（1每个载玻片/样品很好）保存在冰上。
由于没有需要处理的与DNA的细胞- d amaging代理，可以直接跳到琼脂糖中所概述嵌入细胞步骤D1g而。
重要提示：确保包含具有适当阳性和阴性对照（例如，电离辐射和无处理对照）的样品，以确保检测有效！
当您的所有样品都嵌入载玻片上的琼脂糖中时，沿其纵轴滑动盖玻片，轻轻从载玻片上取下盖玻片，然后将它们浸入科普林罐中的裂解缓冲液中。将样品保存在冷裂解缓冲液（冰上）中至少 1 小时，避光。此步骤可以延长至过夜孵育，前提是样品始终保持在最大温度。4°C 避光。

彗星载玻片的电泳和染色
准备适量的冷碱性彗星电泳缓冲液，并在 4°C 下储存直至需要。
慢慢地从 coplin 罐中排出裂解缓冲液，并更换为新鲜的冷电泳缓冲液。温育在冰上30分钟，以允许DNA解旋，p rotect编从光。
用电泳缓冲液将彗星缓冲罐填充到所需的水平。将彗星幻灯片转移到彗星检测仪器上，注意幻灯片的方向。确保所有的幻灯片都完全沉浸在缓冲区填满的剩余空间与虚拟的幻灯片。
关闭彗星装置的盖子，并在 21 V 下运行 30 分钟。
填补了与卫生署科普林罐子2 O.
除去的从油箱幻灯片，并将它们传送到含有卫生署科普林罐2 O.
孵育5分钟，然后沥干对DH 2 O和用新鲜卫生署仔细更换2 O.重复一次以上。
与此同时，准备足够的彗星染色溶液（每张幻灯片约 600 µl 加上一点额外的）。保持避光。
注：我t是可以直接在科普林罐子染色的彗星，以保证更均匀染色; ^ h H但是，这种方法的使用更加SYBR金色染色，因此更加昂贵。
转移的幻灯片用纸巾内衬一盘小号，关注他们放下尽可能水平。
用约覆盖每张幻灯片。600 µl 染色液（确保整个琼脂糖部分都被溶液覆盖），用箔纸或盖子盖住托盘以避光，并在室温下孵育 20 分钟。
倒出染色溶液，然后将每张幻灯片简单地浸入新鲜的 dH 2 O 中。
允许幻灯片到空气-干燥隔夜避光。
注：我N A通风良好的地方，幻灯片，预计在室温下干燥过夜。滑动干燥可以通过将载玻片暴露于加快一暖空气流（未温度高于35℃，以防止熔化的琼脂糖）。

彗星滑梯的成像和分析
图像上的fluorescen幻灯片CE显微镜，采取IMAG ES以10 ×或20 ×放大倍数从DIFF整个滑动随机挑选erent字段。确保使用曝光和光照强度，使的你的彗星从背景中清晰的可视化，并试图把重点以及可能的。每个条件的图像绝对最少 50 个单元格，但最好超过 100 个。为每张幻灯片保留单独的图像文件夹，包含不同字段的所有单独图像。保存所有的你的彗星的幻灯片作为单独的图像。每张幻灯片一个文件夹中的 tiff 文件。由于非常靠近载玻片边缘的类核有时会显示出与载玻片其余部分不同的形状，因此尽量避免对位于载玻片边缘的成像区域。
ANALY ž E使用的OpenComet插件可用的图像斐济如下（图6）：

图 6. 使用OpenComet for FIJI分析图像。A - F 。截图来说明插件的使用。一个。在斐济，选择 OpenComet 插件（见蓝色箭头）。乙。OpenComet 插件启动面板。Ç 。选择作为输入文件中的所有的.tif ˚F的单个条件S /滑动到ANALY ž即 d 。选择输出目录。乙。单击左下角的“运行”开始分析。˚F 。图像文件已ANALY ž使用OpenComet版，准备好接受审核。

打开 OpenComet 插件。
选择输入文件夹（所有IMAG为一个滑动ES可被选择并ANALY Ž一次ED）和一个输出文件目录。
使用“自动”寻头模式，单击运行。这个分析的结果将在总结Ë被保存在您选择的输出文件目录Xcel公司文件。
检查是否已正确检测到所有彗星，取消选择那些显然需要排除/不正确的彗星（例如，人工制品和非彗星已评分的碎片、多个核体的叠加、头部错误的彗星定义或类似）通过单击它们。OpenComet 将用红色勾勒出每颗定期检测到的彗星（头部周围有一个红色圆圈，尾部有一条红线，见图 7A）。此外，还会有一条绿线向您显示检测到的信号的强度分布，蓝色线显示检测到的信号为尾部。有时，由于多种不同的原因（例如，异常的头部或其他），软件不确定某物是否是正确检测到的彗星。在这种情况下，OpenComet 将用黄色勾勒出这些“异常值”（图 7B）。然而，形状也有可能被错误地评分，如图 7C 所示。ħ埃雷，非常低的强度信号被错误地打进有一个极小的头部和大部分信号在尾部。这种形状的包容性将有力地影响结果小号，尤其是如果发生这种情况不止一次，或者如果只有一个少数细胞每个条件进行评估。如果OpenComet可以没有吨ANALY Ž e是形状（例如，在两个或更多个彗星到壳体Ò彼此接近或覆盖，或其它原因），则形状，将灰色（图7D）中概述。对于您通过单击取消选择/排除的那些彗星，也会发生同样的情况。直观地仔细检查每一个彗星这是非常重要的，因为不正确评估那些可以强烈地影响结果小号！
仔细检查所有幻灯片上的所有彗星后，单击“更新” 。' 这将生成带有后缀 '_update '的第二个E xcel 表，它考虑了已被排除的彗星等。
这Ë艾克赛尔片会给你所有的彗星图像中的所有值从幻灯片，这是ANALY ž版。在最后几行中，您将找到所有检测到的彗星的平均值、中值、标准偏差以及最小值和最大值的值，这些值要么仅分为所有正常彗星，要么分为正常 + 异常彗星。选择使用这些值中的哪一个取决于您是否同意包含异常值的值。通常，这两个值彼此非常相似。
有两种方法可以绘制您的结果。˚F IRST LY ，可以计算出重复或分别一式三份ANALY的平均值Ž ED作为一个DNA的以％计的尾，尾矩，或橄榄油力矩例如，使用的柱状图。重复整个检测至少 2 次，以获得每个数据点的 3 个或更多独立值（图 7E）。第二LY ，也可以绘制所有的单独的数据点（例如，的所述50个细胞分别定量itat的ED）在整个测定法（图7F）的至少3次重复的。
注：尾矩描述的是彗尾长度与尾部 DNA 百分比的乘积，而橄榄矩是尾部 DNA 的总百分比与质量中心之间距离的乘积头部和尾部区域。橄榄时刻是特别有用的细胞群中描述的异质性，因为橄榄时刻拾取的DNA是如何分布的变化与在尾部。三个选项中，在DNA％的尾巴，这似乎是最直观的大多数研究人员测量。

图7.彗星载玻片的实施例IMAG ES ANALY Ž使用OpenComet插件运行«自动»头发现模式和可能的结果曲线编 A. OpenComet检测常规彗星。红色数字用于标记单个彗星，以便在结果表中识别它们。B.“异常值”彗星的例子。C. 彗星形状的错误评分示例。非常低强度的信号被错误地评分为具有微小的头部和尾部的大部分信号。包含这样的形状会强烈影响结果s 。D. 灰色形状表示OpenComet 不可能对这些彗星进行评分。英孚。在所获得的结果ë Xcel公司文件可以被绘制（E）为在平均值±重复的或一式三份ANALY的标准偏差ž ED作为DNA的％在所述尾，尾矩，或橄榄油力矩或（F）作为单独的数据点（例如，的所述50个细胞分别定量itat的ED）和所述平均 ±标准偏差。

为了测试该组是否相互显著不同，您可以使用小号tudent的牛逼时，只有2组-试验进行比较。当比较3个或更多组，采用单因素方差分析，随后例如，Bonferroni多重比较测试。
当发布彗星试验数据，我们强烈建议adher ING的“最低限度的信息对彗星试验（MIRCA）报告”是最近刚刚发表在试图确保更好的诠释，验证的准则，和整个实验室结果的可重复性（默勒等人，2020 年）。

食谱

裂解缓冲液对所述的碱性彗星试验
准备的'预混物'通过将146.1克氯化钠（最终：2.5 M），37.2克EDTA二钠盐二水合物（C 10 ħ 14 Ñ 2的Na 2 ö 8 ·2H 2 O）（最终：100毫摩尔），将1.2g Tris碱（最终：10 mM），以及 800 ml dH 2 O 中的8 g 固体 NaOH
注：我牛逼需要一段时间才能溶解所有的固体成分。使用磁力搅拌器，并允许有足够的时间在这个缓冲的准备。
一旦所有的固体溶解，调节所述pH值至10.5的滴加5M的NaOH中。通过添加 dH 2 O将体积调节至 1 L并储存在4°C
要在使用前立即制备裂解缓冲液的“完整溶液” ，将 1 ml DMSO 和 1 ml Triton X-100 添加到 98 ml 冷裂解缓冲液
电泳缓冲液为在碱性彗星试验
准备单独的储备溶液：5 M NaOH（500 ml dH 2 O 中的100 g NaOH ）、200 mM EDTA 二钠盐（C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 ·2H 2 O；200 ml 中的 14.89 g；无 pH 调整必要的）
为了制备电泳缓冲液（最终组成：300mM的氢氧化钠，1mM EDTA中，和1％DMSO）中，添加60毫升5M NaOH水溶液，加入5ml 200mM的EDTA ，和10毫升DMSO至925毫升冷的卫生署2 O; 检查该pH为>直到需要13（使用pH试纸），并存储在4℃下
彗星染色液
使用前立即在 dH 2 O 中稀释 SYBR Gold 1:10 , 000 。避光
PBS（磷酸盐-缓冲盐水）
为了使10 × PBS原液，溶解80克的NaCl，2g的氯化钾，26.8克Na 2 HPO 4 · 7H 2 ö ，和2.4克KH 2 PO 4在800毫升卫生署2 O.调节所述pH至利用HCl 7.4 , 将 dH 2 O添加到1 L ，然后高压灭菌以储存
要制备 1 × PBS 工作溶液，请在900 ml dH 2 O 中稀释 100 ml 10 × PBS 储备溶液

致谢

作者希望感谢以下资助机构支持 EM 小组的研究：瑞士国家科学基金会、Promedica Stiftung Chur、Sassella Stiftung 和 Kurt und Senta Herrmann Stiftung。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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