设备

计算机（我们建议至少16GB RAM和多核）

软件

HAWK（Rahman等人，2018 ; M ehrab等人，2020）
使用k- mers从测序读段进行关联映射的主要软件。该软件可从https://github.com/atifrahman/HAWK/releases下载，安装说明可在https://github.com/atifrahman/HAWK下载。

水母/水母2的修改版（Marçais和Kingsford ，2011年）
对于K- Mer的计数。可从https://github.com/atifrahman/HAWK/tree/master/supplements下载的修改版本和安装说明位于README.md文件中。

EIGENSTRAT的修改版本（Patterson等，2006； Price等，2006）
用于确定人口结构。A M odified版本可以从以下地址下载https://github.com/atifrahman/HAWK/tree/master/supplements和安装说明自述文件中可重新。

ABySS （Simpson等，2009）
组装具有统计意义的聚合物。下载和安装说明位于https://github.com/bcgsc/abyss。

具有并行支持的GNU排序。通常包含在Linux发行版中
R.可从https://cran.r-project.org/下载

程序

图1显示了使用HAWK用k- mers对测序读段进行关联映射的过程的概述。下面将更详细地介绍这些步骤。有关该过程的更多信息，请访问https://github.com/atifrahman/HAWK/blob/master/README.md。

图1.使用HAWK使用k- mers从测序读段进行关联映射概述

计数和分类的k聚体
计数的k聚体通过运行水母或水母2。为此在每个样品中，修改可用的示例脚本在https://github.com/atifrahman/HAWK/tree/master/supplements。
countKmers_jf2或countKmers_jf1可用于计数和分类的k聚体使用水母2或水母分别当来自每个样本的读出是在一个单独的文件夹，而countKmers_jf2_sra或countKmers_jf1_sra读取时首先需要从序列读取存档下载可以使用（ SRA）。
该脚本会写的名字的排序的K- Mer的计数文件“sorted_files.txt”和T他牛逼otal K- Mer的计数小号在“total_kmer_counts.txt”每个样本。

运行HAWK
创建一个名为“ gwas_info.txt”的文件，该文件包含三行，每行中的选项卡将其分隔开，以给出样品ID，由M / F / U表示的男性/女性/未知数以及每个样品的病历/对照状态。
将文件“ sorted_files.txt”和“ total_kmer_counts.txt”以及文件“ gwas_info.txt”复制到一个文件夹中
脚本“复制runHawk ”和“ runAbyss ”到该文件夹，编辑变量hawkDir ，eigenstratDir和isDiploid ，和运行。/运行鹰
这将完成以下步骤：

一种。识别与病例和对照相关的婴儿。这将通过运行“鹰”来完成，将产生的k的初始列表聚物与案件相关联，并控制在文件的case_out_w_bonf.kmerDiff '和“ control_out_w_bonf.kmerDiff分别”以及在文件中使用的EIGENSTRAT确定人口结构。

b。确定人口结构。运行Eigenstrat将检测人口结构。可选，T他的人口结构可以通过运行将R脚本进行调查pca_plot.R 。这将读出的“ gwas_ eigenstrat.evec由产生”文件Eige nstrat和输出在“主成分分析（PCA）情节pca_plot.eps ”。调整可变小号PC1和PC2以选择沿其主成分的数据将被绘制。

C。纠正人口结构。S tep B3 a中确定的k- mers的p值将根据混杂因素（例如人口结构，k- mers的总数和性别）进行调整。第k聚体与病例和对照WIL发现显著相关联升在文件的case_ kmers.fasta '和“ control_kmers.fasta ”。关于K-更多信息聚体将在“pvals_case_top_merged.txt”和“pvals_control_top_merged.txt。”

组装单体
编辑变量“ abyssDir ”脚本“ runAbyss ”和运行。/ runAbyss
这将组装k- mers为每个相关区域生成一个序列，与案例和控件相关的序列将分别位于“ case_abyss.25_49.fa”和“ control_abyss.25_49.fa”中。

下游分析
一旦获得了k聚体或组装的序列，就可以用多种方法对其进行分析。

为了获得摘要统计诸如平均p值，构成的k的平均计数聚体和次它们存在于病例和对照编辑霍克目录，文件名输入平均数目序列，和是否从在脚本的情况下或控制' runKmerSummary '（位于https://github.com/atifrahman/HAWK/tree/master/supplements）并运行./ runKmerSummary （有关详细信息，请参见https://github.com/atifrahman/HAWK）。
如果没有参考基因组可用，则进行BLAST（Altschul等，1990）的序列以检查相关生物中的序列是否命中并分析匹配的序列。
如果可获得参考基因组，则可使用Bowtie 2（Langmead和Salzberg ，2 012）之类的工具将k- mers映射到参考基因，并使用曼哈顿图将其位置和p值可视化。编辑外壳脚本“runBowtie2”和将R脚本“ manhattan_plasmid.R ”，可在https://github.com/atifrahman/HAWK/tree/master/ecoli_analysis对齐的K-聚体到参考和分别产生曼哈顿曲线。

数据分析

为了识别的k聚体相对于其他的情况下或对照呈现显著多次，HAWK假定K-聚体计数泊松分布和执行似然比检验。通过运行Eigenstrat对二进制矩阵进行主成分分析来确定总体结构，该矩阵表示存在或不存在k- mers随机集。群体结构和其他混杂因素的校正是通过针对混杂因素拟合表型的逻辑回归模型，以及做了K-聚体计数矢量和用于第k的混杂因素和调整的p值聚体在第一步骤中识别的被识别。执行Bonferroni校正以校正多个测试。参见Rahman等。，2018和Mehrab等。，2020年对方法和支持结果的详细描述。

接下来，我们提供使用管道的示例数据分析。我们使用Earle等人的大肠杆菌氨苄青霉素抗性数据集。，2016年，也由Rahman等人进行了分析。，2018年。数据集包含来自241个菌株的测序读物，其中189个对氨苄青霉素具有抗性，其余则不具有抗性。首先，使用水母2对每个样品的读数中的komer进行计数。所述176284643不同的k的聚体在总，霍克的第一步骤中识别4752738个4007202 K-聚体将被分别校正之前对混杂因素与病例和对照相关联。接着，EIGENSTRAT已于342988随机选择的k运行聚体检测人口结构。˚F igure 2个甲节目吨他PCA沿揭示群体分层的前两个主成分绘制样品。

然后，我们使用前十个主成分和每个样本中k- mers的总数来调整p值。校正混杂因素后，我们得到4,125的k聚体的案件，并与对照相关的无关联。第k聚体与相关联的情况下，然后用组装深渊，揭示11组的序列。

使用Bowtie 2 ，将与氨苄青霉素抗性相关的k- mers定位到大肠杆菌DTU-1基因组[GenBank：CP026612.1]和大肠杆菌KBN10P04869质粒pKBN10P04869A序列[GenBank：CP026474.1]。在FIGUR地块ES 2.0乙和2 ç显示第k的聚体对它们在位置大肠杆菌分别菌株DTU-1基因组和质粒pKBN10P04869A序列。垂直线表示的位置的β内酰胺酶TEM-1基因。我们观察到没有kmers映射到大肠杆菌DTU-1菌株基因组。然而，k聚体定位于β-内酰胺酶TEM-1基因附近的质粒pKBN10P04869A序列，已知该序列的存在可提供氨苄青霉素抗性。

图2.大肠杆菌中氨苄青霉素抗性的关联图。（A）氨苄青霉素抗性数据集中大肠杆菌菌株前两个主要成分的图。曼哈顿图显示了与氨苄青霉素抗性相关的k-mers及其在（B ）大肠杆菌DTU-1基因组和（C ）质粒pKBN10P04869A序列中的位置。

笔记

默认情况下，HAWK使用Bonferroni校正来解决多次测试的问题。如果研究不足以进行Bonferroni校正，则可以使用Benjamini -Hochberg程序代替。为此，在执行“ runHaw k ”后，运行。/ runBHCorrection 。将所得的K-聚体小号将在“ case_kmers_bh_ correction.fasta ”和“ control_kmers_bh_correction.fasta ”。
HAWK使用前两个主成分使用找到ë igenstrat ，SE在总的k的形式的样品和测序深度的X聚物计为混杂因素，默认情况下。要更改默认设置，编辑变量“ NOPC ”和“ useSexConfounder ”脚本“ runHawk ”。为了提供更多的混杂因素，请创建一个行数等于样本数的文件，并在每行中指定协变量，该协变量由数字给定并由空格或制表符分隔。使用混杂文件的名称在“ runHawk ”中编辑变量“ covFile ” 。

菜谱

HAWK管道可用于查找特定性别的kmers 。为此，请在文件“ gwas_info.txt”中的第一列中提供样本ID，在第二列中写入U，并根据第三列中的样本是Male / Female来指定包含Case / Control状态。。对于例如，如果SRR3050845和SRR3050847是女性，SRR3050846是男的，该文件将是：

SRR3050845 U控制

SRR3050846 U机箱

SRR3050847 U控制

致谢

Lior Pachter和Atif Rahman由NIH R21 HG006583部分资助。本文描述的方法的协议中的论文“从测序协会映射读取使用K-原始呈现聚体”，由与Atif拉赫曼Ingileif Hallgrímsdóttir ，迈克尔·艾森和利奥尔帕切特，和在“A延伸更快从K-执行关联映射的链节”由Zakaria Mehrab ，Jaiaid Mobin ，Ibrahim Asadullah Tahmid和Atif Rahman撰写。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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