材料和试剂

草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞（Sf9）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11496-015）
载体pFastBacHTa （Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10584-027）
大肠杆菌（大肠杆菌）菌株DH10Bac（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10359-016）
20％乙醇
SDS
β-巯基乙醇
甘油
溴酚蓝
HEPES-NaOH（pH 7.0）
MgCl 2
MnCl 2
Triton X-100
Benzonase核酸酶（Novagen，目录号：70746）
蛋白酶抑制剂（完全不含EDTA，蛋白酶抑制剂混合物片）（Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
咪唑
Cellotetraose，cellopentaose和cellohexaose（Associates of Cape Cod，Northstar BioProducts ，目录号：400402-1,400404-1,400406-1）
纤维二糖（Sigma-Aldrich，目录号：C7252）
UDP-D-木糖（CarboSource Services，Complex Carbohydrate Research Center，product code：UDP-Xylose）
UDP- [sup 14 C-U]木糖（151.8mCi/mmol）（PerkinElmer，目录号：NEC543005UC）
TALON金属亲和树脂（Takara Bio Company，Clontech，目录号：635501）
BenchMark His标签蛋白标准品（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：LC5606）
Precision Plus蛋白质未标记标准品（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0363）
小鼠抗His 6单克隆抗体（GE Healthcare，产品代码：27-4710-01）
辣根过氧化物酶（HRP）缀合的次级绵羊抗小鼠抗体（GE Healthcare，产品代码：NA931-100UL）
SYPRO Ruby蛋白凝胶染色（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：S-21900）
离子交换树脂Dowex 1x8-200（氯化物形式）（Sigma-Aldrich，目录号：217425）
2,5-二羟基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：85707）
Starscint高闪点LSC鸡尾酒（PerkinElmer）
PAGE装染料（见配方）
低渗裂解缓冲液（参见配方）
IMAC的平衡/清洗缓冲液（参见配方）
IMAC的样品制备缓冲液（参见配方）
IMAC洗脱缓冲液（参见配方）
用于酶测定（用放射性标记的UDP-木糖）的反应缓冲液（参见配方）
用于酶测定（没有放射性标记的UDP-木糖）的反应缓冲液（参见配方）

设备

空重力流动色谱柱（20ml体积）（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-1010）
Micro Bio-Spin色谱柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-6204）
Amersham ECL检测系统（GE Healthcare，产品代码：RPN2105）
PVDF转移膜（Amersham Hybond-P）（GE Healthcare，产品代码：10600023）
NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
LAS-3000 Lite成像器用软件LAS-3000图像读取器（Fujifilm Corporation）
FLA 2000磷光计，带有软件FLA 2000G（Fujifilm Corporation）
Rackbeta LKB Wallac（PerkinElmer，型号：1209）
Voyager DE ^TM PRO MALDI-TOF Workstation（Life Technologies，Applied Biosystems ）
注意：我们认为实验的重复性不取决于上述精确设备，但可以使用任何其他等效仪器实现。

软件

Software Multi Gauge v2.2（Fujifilm Corporation）
数据资源管理器（版本4.0.0.0）（Life Technologies，Applied Biosystems ）
软件FLA 2000G（Fujifilm Corporation）
软件LAS-3000图像读取器（Fujifilm Corporation）

程序

糖基转移酶的异源表达
注意：有大量的协议描述蛋白质的异源表达的程序。在细菌，酵母和各种昆虫细胞系统中已经实现了植物糖基转移酶蛋白在酶分析中的成功表达。我们不给出蛋白质PrGT34B的异源表达的详细描述，而仅仅概述我们使用的程序，并给出可能有用的一些信息。
1. 在我们的研究中（Ade等人，2014），我们表达木糖基转移酶 PrgT34B在草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞（Sf9）中的表达基于核多克隆病毒的杆状病毒表达矢量系统。
  1. 细胞系Sf9先前已经用过成功表达植物糖基转移酶（Egelund等人，2006）。此外，Sf9细胞对于苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）核多糖病病毒的感染高度敏感，并且相应的杆状病毒表达载体显示导致高表达所需基因产物在昆虫细胞中的水平（Condreay和Kost， 2007）。
  2. 将感兴趣的序列克隆到载体中 pFastBacHTa ，在E中产生重组杆粒DNA。大肠杆菌菌株 DH10Bac或DH10MultiBac（Berger等人，2004），杆状病毒是按Sf9细胞中的说明在Sf9细胞中产生和扩增手动"Bac-to-Bac杆状病毒表达系统"。
  3. Sf9 用杆状病毒（1：1,000v/v的扩增培养基）接种起始浓度为2.0×10 6个细胞ml -1 -1的悬浮培养物（200ml）病毒原种至Sf9细胞悬浮液），并在摇动（130rpm， 72小时，28℃）。通过离心（500×g）收集感染的细胞， 10分钟，4℃），和用于蛋白质提取的细胞沉淀以下详细）。
2. 为了容易纯化重组体蛋白在其用于酶测定之前，我们强烈建议组氨酸标记的（6x组氨酸）融合蛋白。
3. 在此外，许多植物GT，包括木糖基转移酶PrGT34B II型膜结合蛋白与单个跨膜结构域（TMD）接近肽的N-末端，其充当信号锚定蛋白定位到高尔基体通过ER。对于这样的蛋白质，我们建议表达N末端截短版本的蛋白质，缺乏N末端TMD但含有完整的功能域。这可以导致更好的溶解性异源表达的蛋白质，因此更容易从中提取宿主细胞（详见下文）。
4. 如果他的₆标签是融合到蛋白质的N末端，N末端的位置必须仔细选择蛋白质的截短。我们截断了 GT上游最突出的带电氨基酸之间 TMD和保守结构域以允许最佳表达的组氨酸标签[参见Ade et al。（2014）蛋白质截短的准确位置和His 6标记]。
从Sf9昆虫细胞中提取功能性异源蛋白
1. 从8×10 8个新鲜沉淀物中提取天然重组蛋白PrGT34B Sf9细胞，使用冰冷的低渗裂解缓冲液（20ml）。裂解细胞在冰上（40分钟），然后在定轨振荡器（50rpm， h，4℃）。
2. 通过离心澄清裂解物（14,000×g，5 min，4℃），并转移含有Triton X-100的上清液溶解的蛋白质到新管中
3. 进行净化的来自总提取的His 6标记的重组蛋白PrGT34B 蛋白质。
  注意：我们保留了蛋白质提取物冰不超过2小时，然后进行蛋白质纯化避免蛋白质降解，蛋白质损失功能性蛋白质沉淀或蛋白质变性。
4. 另外，提取总蛋白质从8×10 8个新鲜沉淀的Sf9细胞感染非重组杆状病毒或用杆状病毒重组体空载载体pFastBacHTa ^TM用于计算所需的阴性对照反应背景GT活动（见下文）。
使用固定化金属亲和层析（IMAC）纯化His6标记的重组GT 注意：TALON树脂由具有在电负性袋中保持Co ^{2 +} 离子的四齿金属螯合剂的Sepharose珠组成。在中性pH下，靶蛋白的多组氨酸标签的组氨酸侧基未质子化并与螯合的钴离子结合。在这些条件下，在层析期间增加洗脱缓冲液中的咪唑浓度竞争性洗脱结合的多组氨酸标签蛋白从树脂。需要纯化GT以精确测定在酶测定中使用的特定蛋白质的量。只有这样，才能计算GT的特定酶活性。
1. 加载空重力流动色谱柱用2ml的50％（w/v）TALON金属亲和树脂浆液在20％乙醇中温度
2. 树脂沉降后，再涂一块玻璃料并在室温下用双蒸水（ddH 2 O）（20ml）洗涤柱温度
3. 在室温下用平衡/洗涤缓冲液（10ml）平衡TALON树脂
4. 混合总蛋白裂解液（20ml）（见上文）与冰冷的样品制备缓冲液（5ml）。
5. 加载冰冷的25 ml可溶性蛋白裂解液，调节至50 mM HEPES-NaOH（pH 7.0），100mM NaCl，5mM咪唑，10％甘油，1.6％ Triton X-100,1.6mM MgCl 2，加到柱上注意：增加调节至100mM NaCl的样品的离子强度最小化非特异性结合到树脂上并稳定可溶性蛋白质在分馏期间的柱。初始咪唑浓度为5 mM增加亲和结合的严格性并降低背景蛋白结合。
6. 用TALON树脂洗涤平衡/洗涤缓冲液（20ml），然后洗脱His 6+标记的蛋白质在室温下用IMAC洗脱缓冲液（15ml）从柱中洗脱
7. 捕获洗脱蛋白的连续级分（1ml）直接存储在冰上。通过标准SDS-PAGE分析等分试样（10μl）确定具有最高浓度和纯度的级分重组蛋白用于随后的酶测定
8. 在确定其酶活性之前，将洗脱的可溶性蛋白保持在4℃很短的时间注意：我们保持纯化的蛋白质在冰上不超过24小时之前使用它在GT测定中以避免功能蛋白的损失蛋白质降解，蛋白质沉淀或蛋白质变性。
通过免疫印迹分析和肽质量指纹图谱（PMF）鉴定异源表达的重组蛋白PrGT34B
注意：通过His 6标记蛋白的免疫印迹分析和质谱肽分析的组合来实现重组蛋白的同一性的验证。
1. 使总蛋白提取物的等分试样（10μl）变性从5.0×10 5 Sf9细胞提取的蛋白质）和纯化的IMAC 通过在PAGE装载染料中加热（在95℃5分钟）洗脱蛋白质
2. 在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离变性蛋白合适的标记如BenchMark His-标记的蛋白标准品
3. 使用任何种类的合适的电泳蛋白转移方法将蛋白转移到PVDF转移膜
4. 用小鼠抗His 6单克隆抗体检测His 6 6 -Tagged蛋白抗体（3000倍稀释）与辣根组合过氧化物酶（HRP）结合的次级羊抗小鼠抗体（7,000倍稀释）使用任何种类的合适的杂交方案
5. 用膜显示膜上的化学发光信号 Amersham ECL检测系统和任何类型的合适分析系统例如LAS-3000 Lite与软件LAS-3000图像读取器。
6. 可选：除了鉴定His 6标记的蛋白质总蛋白提取物和IMAC通过免疫印迹洗脱的级分分析，分离异源纯化的IMAC的第二等分试样通过标准SDS-PAGE表达蛋白。染色聚丙烯酰胺凝胶与考马斯蓝，切除相关蛋白条带和受试者 PMF，使用任何类型的合适的商业提供者或学术蛋白质组学设施注意：我们建议PMF对纯化的蛋白质进行一次分析，以明确验证其身份。

纯化的蛋白PrGT34B的凝胶定量注意：IMAC纯化后His 6标记的重组蛋白的纯度不是100％。因此，通过诸如NanoDrop ND-1000的分光光度法不可能准确定量蛋白质混合物中的一种特定蛋白质，并且需要备选的定量方法。

将等体积（10μl）的不同稀释液（例如，未稀释的， 10和20倍稀释）纯化的异源表达的IMAC 蛋白质与等体积（20μl）的不同稀释度的a 定量蛋白质质量梯度如Precision Plus蛋白在12％聚丙烯酰胺凝胶上的未染色标准物
用任何种类的标准SDS-PAGE方法分离蛋白质
按照制造商的说明用定量荧光SYPRO Ruby蛋白凝胶染色法染色凝胶
用任何种类的合适的可视化荧光信号分析系统，例如具有FLA 2000G的FLA 2000磷光成像仪软件注意：SYPRO Ruby蛋白染料的发射最大值为610 nm。

量化以前确定的特异性的蛋白质条带蛋白质物质在凝胶上基于从中获得的校准曲线在各种参考条带中已知量的蛋白质稀释的定量蛋白梯使用软件Multi 规格v2.2。
注意：未稀释的100，50和20 kDa条带 Precision Plus蛋白标准品（20μl）对应于300,1,500和300 ng /蛋白质。

（C）

无	说明	LAU	面积（mm ²）	BG	LAU-BG	凝胶上的蛋白质量（已装载）
21	背景	27.19	6.83	27.19	0	0 ng
1	标准	18.16	2.72	12.73	5.44	75.0 ng
2	标准	19.80	2.72	10.81	8.98	112.5 ng
3	标准	32.02	4.23	16.83	15.19	150.0 ng
4	标准	43.80	4.24	16.88	26.92	225.0 ng
5	标准	57.65	4.54	18.05	39.60	300.0 ng
6	标准	90.78	5.11	20.34	70.44	375.0 ng
7	标准	145.31	6.87	27.32	117.99	562.5 ng
8	标准	188.50	8.61	34.27	154.23	750.0 ng
9	标准	284.96	11.20	44.55	240.40	1125.0 ng
10	标准	385.81	12.92	51.40	334.42	1500.0 ng
11	标准	21.49	3.97	15.81	5.68	75.0 ng
12	标准	26.14	3.74	14.88	11.25	112.5 ng
13	标准	33.63	4.98	19.82	13.81	150.0 ng
14	标准	53.90	6.13	24.40	29.50	225.0 ng
15	标准	67.53	6.66	26.50	41.04	300.0 ng

无	说明	LAU	面积（mm ² ）	BG	LAU-BG	凝胶上蛋白质的量（计算）	蛋白质浓度的未稀释样品
17	10μl样品（20倍稀释）	221.24	733	29.18	192.06	918.07 ng	1.8361mg/ml
18	10μl样品（10倍稀释）	474.50	10.92	43.44	431.06 /	2060.52 ng	2.0605mg/ml
19	10μl样品（5倍稀释）	1031.81	18.71	74.45	957.36	4576.29 ng	2.2881mg/ml
20	10μl样品（2倍稀释）	2241.51	24.06	95.75	2145.75	10256.93 ng	2.0514mg/ml
						浓度平均值：2.0590mg/ml

图1.纯化的异源表达的IMAC的定量蛋白通过SYPRO Ruby染色的SDS-凝胶的荧光分析。等分试样（10μl）的纯化的重组蛋白的四个稀释液和五种不同体积的蛋白质质量标准品Precision Plus 蛋白质标准品在12％丙烯酰胺凝胶上分离。凝胶是用SYPRO Ruby蛋白凝胶染色（Molecular Probes）染色荧光信号可视化（A）。参考波段和波段手动选择和定量的信号强度选择的区域被检测为线性任意单位（LAU）。已知每个选择的参考条带和它们的蛋白质量背景校正的信号强度值（LAU-BG）生成校准曲线（B）。所选样品中的蛋白质含量使用校准曲线的方程计算频带。的测定样品中重组蛋白的最终浓度通过考虑加载体积和稀释因子（C）。

辐射松木糖基转移酶PrGT34B的定量糖基转移酶测定
一般信息：
1. 此协议描述如何确定体外 GT活动木葡聚糖木糖基转移酶PrGT34B 反应条件，单糖部分从a 核苷酸糖例如UDP-木糖，用作供体底物受体底物如纤维寡糖。
2. 测定 25℃的温度和6.5-7.0的pH是最佳的研究位于高尔基体的其他GTs的活性辐射虫（Mast 等人，2009）。此外，最近的文献表明高尔基体中的GT活性取决于微酸性环境（Reyes和Orellana，2008）。然而，成功的酶使用与蛋白PrGT34B密切相关的酶的体外测定在以前的研究中在中性或微碱性条件下进行（Edwards 等人，1999; Faik等人，2002; Cavalier和Keegstra，2006）。因此，我们使用中性pH用于所述的所有测定现行协议。
3. 对于本文所述的所有GT活性测定方案，蛋白PrGT34B是总Sf9蛋白提取物，调整至低蛋白浓度为10mg/ml的总蛋白浓度裂解缓冲液（参见上文），或通过IMAC纯化的蛋白质提取物中用IMAC洗脱调节至总蛋白浓度为2.5mg/ml 缓冲区（见上文）。此外，通过纯化的提取物的稀释度 IMAC用含有IMAC洗脱缓冲液（见上文）制备特异性PrGT34B浓度为2,000,100和40μg/ml。
4. 总计蛋白质提取物含有HEPES-NaOH（pH 7.0）（50mM），MgCl 2（2mM），甘油（10％）和Triton X-100（2％）和IMAC纯化的蛋白质提取物含有HEPES-NaOH（pH 7.0）（50mM），NaCl（100mM），咪唑（50mM）和甘油（10％）。
  注意：木葡聚糖木糖基转移酶测定异源表达的蛋白PrGT34B的活性与放射性标记的UDP- [ 14]木糖和纤维二糖，纤维四糖，纤维五糖或纤维六糖。
1. 混合蛋白溶液（总蛋白提取物或IMAC纯化的提取物）（10μl）与含有UDP-木糖的反应缓冲液（40μl） UDP- [14 C]木糖和纤维寡糖作为受体底物。
2. 孵育（25℃，例如1,17或44小时）所得反应混合物（50mM），含有提取的蛋白质的HEPES-NaOH（pH7.0）（50mM） MnCl 2（5mM），MgCl 2（5mM），UDP-木糖（1或4mM），UDP- [14 C] ]木糖 kBq，54,300dpm，150pmol）和纤维寡糖（1mM）注意：
  1. 这些反应条件对应于50nmol受体底物和50或200nmol未标记的UDP-糖供体底物混合物，得到受体和供体的摩尔比为1:1或1:4。加入到反应混合物中的150pmol UDP- [反式] 14 [木糖]木糖的量对应于反应混合物中的浓度仅为3μM，改变仅添加的UDP-木糖的总浓度不显着。
  2. 该测定可以以任何其它摩尔比进行在受体和供体底物之间。其他GT活动可以使用合适的核苷酸糖和供体底物测定测定混合物如UDP-半乳糖和UDP- [ ¹⁴ C]半乳糖作为供体底物和甘露寡糖作为受体底物进行测定半乳甘露聚糖的半乳糖基转移酶活性半乳糖基转移酶。
3. 通过加热停止反应（5分钟，95℃）通过离心（10,000×g，2分钟，4℃）除去沉淀的蛋白质 ℃），并将含有反应产物的上清液转移至新鲜管和冰上放置
4. 去除未并入的核苷酸糖（UDP-木糖和UDP- [14 C]木糖）通过阴离子从反应混合物中分离交换色谱（AEC），使用离子交换树脂Dowex 1x8-200 （氯化物）。
  注意：树脂的带正电荷的基团充当在宽pH范围内保持电荷的强阴离子交换剂并结合带负电荷的分子例如核苷酸糖交换抗衡离子氯化物。
5. 混合Dowex 1×8-200树脂（1g）与水（10ml）混合，使树脂溶胀过夜，洗涤树脂用淡水（10ml）洗涤两次，使树脂沉降（10分钟） min），弃去上清液并加入淡水得到50％（w/v）树脂 - 水浆料
6. 直接混合从澄清的上清液测定反应（50μl）与50％（w/v）树脂 - 水浆液（400μl）并在轨道摇床上（50rpm，室温下5分钟）孵育
7. 将混合物转移至空的Micro Bio-Spin色谱柱，其装有玻璃料以保留树脂并离心（700×g， min，在室温下）注意：流出物可以收集在a 新鲜微量离心管。微生物旋转柱与空微量离心管可以放入带有盖的15ml Falcon管中，这样可以进行离心而没有污染的风险离心机。
8. 混合完全流出物（250-300μl），含具有引入的放射性的不带电反应产物，与闪烁计数液（Starscint高闪点 LSC混合物）（1ml）
9. 用液体闪烁计数器测量结合的放射性，持续5分钟注意：将测量的"每分钟计数"（cpm）转换为 "分解每分钟"（dpm）由自动完成仪器使用通过绘图生成的校准曲线检测已知活性的外标的cpm值他们已知的光谱淬灭参数[SQP（E）]。
10. 准备控制用于与上述相同的酶测定的孵育，但是无蛋白质和来自用Sf9细胞感染的蛋白质提取物非重组病毒以确定背景放射性由于在阴离子期间未掺入的UDP- [14 C]糖的不完全保留交换色谱，酶独立降解UDP-糖和 UDP-糖水解背景活性。处理这些控制孵育与样品相同，并测量剩余非特异性背景放射性在AEC流出物中
11. 计算木糖基转移酶活性如下。
  从反应产物中计算木糖到反应产物中的量根据公式保留在样品中的总放射性 "每个测定中掺入的木糖到受体底物中的量（in pmol）=（A/B）* C"; 其中A表示保留在中的放射性样品按阴离子交换色谱法（以dpm计），B代表添加到测定中的总放射性（以dpm为单位），C表示加入到测定中的UDP-糖（标记的+未标记的）的总量（以pmol计）。
  1. GT活性可以显示为木糖结合测定（以pmol /测定）或作为木糖掺入每时间（以pmol/h）将所述测定孵育离散时间（例如1小时，17小时和44小时）。
  2. 对于含有已知量的异源蛋白质的测定 PrGT34B，特异性GT活性可以从数量（in pmol）木糖每时间和每次掺入受体底物特异性酶的量（以pmol/h /μg计）。
  3. 背景可以使用在对照测定中检测到的放射性（以dpm计）计算样品中的非特异性活性或可以直接从相应的实验样品中减去以提供a 背景校正的值用于计算酶活性。
通过MALDI-TOF MS鉴定和表征PrGT34B木糖基转移酶测定反应产物注意：
1. 大多数质谱方法不是定量的，除非内部使用的是已知量并且在结构上相同的标准到反应产物。因此，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）这里描述的只能被看作是半定量的方法确定GT活性。然而，这个过程不仅显示GT 活性通过检测预期的反应产物，但也允许结构表征所产生的所有反应产物酶PrGT34B。
2. MALDI-TOF MS已被证明是高效的解吸和电离各种生物分子包括寡糖（Garozzo等人，1995; Garozzo等人，1997）
1. 用含有重组体的提取物制备反应混合物蛋白（或没有重组蛋白用于对照反应）如上所述（步骤6F），但不添加放射性标记 UDP-木糖。
2. 孵育（25℃，例如17小时）反应混合物（50μl），在HEPES-NaOH（pH7.0）中含有提取的蛋白质（50μl）（1mM或mM），MnCl 2（5mM），MgCl 2（5mM），UDP-木糖（1或4mM）和纤维寡糖（1mM）注意：孵育时间选择足够长以允许木糖的最大掺入。
3. 通过加热（5分钟，95℃）停止反应，除去沉淀蛋白通过离心（10,000×g，2分钟，4℃）并转移将反应产物的上清液置于新管中并置于冰上
4. 将上清液（1μl）的等分试样与MALDI基质2,5-二羟基苯甲酸（10mg/ml，在ddH 2 O中）（9μl）混合。
5. 在MALDI板上点样样品 - 基质混合物（1μl）的等分试样并空气干燥以允许分析物和基质分子的结晶板。
  注意：使甘油最小化是重要的以确保分子结晶均匀地在盘子上。
6. 将MALDI板装载到MALDI-TOF质谱仪，例如Voyager DE ^TM PRO MALDI-TOF工作站。
  注意：
  1. 使用三个外部标准物校准光谱仪 des-ArgI-缓激肽（m/z = 904），血管紧张素I（m/z = 1296）和稀释在2,5-二羟基苯甲酸中的[GluI] - 纤维蛋白肽B（m/z = 1570）酸。
  2. 在反射器模式下以20kV的加速电压和200ns的延迟时间操作光谱仪。
7. 通过绘制质量（m）来计算每个样品的质谱图电荷（z）比（x轴）使用任何合适的软件例如测量的强度（y轴）数据资源管理器（版本4.0.0.0）。
  注意：每个质量的编译频谱应包括来自足够数量的累积数据的激光照射（例如100次激光照射）。
8. 识别底物和GT 反应产物的质谱基于分子量的单电荷（z = 1）钠加合物离子[M + Na] ⁺。注意：
  1. 因为样品 - 基质混合物中NaCl浓度高（> 1mM），在正电离模式中的主要离子种类是分析物质子化分子离子的钠加合物。
  2. 使用为没有进行的对照反应产生的质谱以鉴定与所述反应产物相关的峰重组蛋白PrGT34B。
  3. 选择合适的基本峰强度阈值，以识别质谱图中高于噪声的峰。

食谱

PAGE装染料
SDS（1％）
β-巯基乙醇（1mM）甘油（10％）
溴酚蓝
低渗裂解缓冲液
50mM HEPES-NaOH（pH 7.0）
2mM MgCl 2/
10％甘油（v/v） 2％Triton X-100（v/v） Benzonase 核酸酶（10U/ml）
蛋白酶抑制剂
在双蒸水（ddH 2 O）中制备
IMAC的平衡/清洗缓冲区
50mM HEPES-NaOH（pH 7.0）
100 mM NaCl
5mM咪唑 10％甘油（v/v）准备在ddH ₂ O
IMAC的样本准备缓冲区
50mM HEPES-NaOH（pH 7.0）
500 mM NaCl
25mM咪唑 10％甘油（v/v）准备在ddH ₂ O
IMAC洗脱缓冲液
50mM HEPES-NaOH（pH 7.0）
100 mM NaCl
50mM咪唑 10％甘油（v/v）准备在ddH ₂ O
用于酶测定的反应缓冲液（用放射性标记的UDP-木糖）
50mM HEPES-NaOH（pH 7.0）
6.25mM MnCl 2/
6.25mM MgCl 2
1.25或5mM UDP-木糖 1.25mM寡糖受体底物（纤维二糖，纤维四糖，cellopentaose或cellohexaose）
UDP- [14 C]木糖（9kBq，54,300dpm，150pmol）
准备在ddH ₂ O
用于酶测定的反应缓冲液（无放射性标记的UDP-木糖）
50mM HEPES-NaOH（pH 7.0）
6.25mM MnCl 2/
6.25mM MgCl 2
1.25或5mM UDP-木糖 1.25mM寡糖受体底物（纤维二糖，纤维四糖，cellopentaose或cellohexaose）
准备在ddH ₂ O

致谢

这项工作得到了新西兰研究，科学和技术基金会以及奥克兰大学的资助。我们感谢CarboSource Services（Complex Carbohydrate Research Center，Athens，GA）的UDP-木糖和Scion Research的Carsten P. Ade的博士津贴。这里描述的部分程序从Cavalier和Keegstra（2006）修改。

参考文献

Ade，C.P.，Bemm，F.，Dickson，J.M.，Walter，C.and Harris，P.J。（2014）。辐射中的家族34糖基转移酶（GT34）基因和蛋白质松树）和松属（火炬松）。植物J 78（2）：305-318。
Berger，I.，Fitzgerald，D.J。和Richmond，T.J。（2004）。异源多蛋白复合物的杆状病毒表达系统 Nat Biotechnol 22（12）：1583-1587。
Cantarel，B.L.，Coutinho，P.M.，Rancurel，C.，Bernard，T.，Lombard，V.and Henrissat，B。（2009）。碳水化合物活性酶数据库（CAZy）：糖原基因组专家资源。 em> Nucleic Acids Res 37（数据库问题）：D233-238。
Cavalier，D.M.and Keegstra，K。（2006）。两种木葡聚糖木糖基转移酶催化多个木糖残基添加到纤维六糖中。 Biol Chem 281（45）：34197-34207
Condreay，J.P。和Kost，T.A。（2007）。昆虫和哺乳动物细胞的杆状病毒表达载体 Curr Drug Targets < （10）：1126-1131。
Doblin，M.S.，Pettolino，F。和Bacic，A。（2010）。 Evans评论：植物细胞壁：植物世界的骨架功能植物生物学 37（5）：357-381。
Driouich，A.，Follet-Gueye，M.L.，Bernard，S.，Kousar，S.，Chevalier，L.，Vicre-Gibouin，M.and Lerouxel，O.（2012）。高尔基介导的高等植物原生细胞壁的基质多糖的合成和分泌。前植物 Sci 3：79
Edwards，M.E.，Dickson，C.A.，Chengappa，S.，Sidebottom，C.，Gidley，M.J.and Reid，J.S。（1999）。植物细胞壁基质多糖生物合成的膜结合半乳糖基转移酶的分子表征。 em> Plant J 19（6）：691-697。
Egelund，J.，Petersen，B.L.，Motawia，M.S.，Damager，I.，Faik，A.，Olsen，C.E.，Ishii，T.，Clausen，H.，Ulvskov，P.and Geshi，拟南芥 RGXT1和RGXT2编码高尔基体（1,3） -alpha-D-xylosyltransferases involved in the synthesis of pectic rhamnogalacturonan-II。 Plant Cell 18（10）：2593-2607。
Faik，A.，Price，N.J.，Raikhel，N.V.and Keegstra，K。（2002）。编码参与木葡聚糖生物合成的α-木糖基转移酶的拟南芥基因/a> Proc Natl Acad Sci USA 99（11）：7797-7802。
Garrozzo，D.，Impallomeni，G.，Spina，E.，Sturiale，L。和Zanetti，F。（1995）。基质辅助激光解吸/电离多糖的质谱。快速通讯质谱 9（10）：937-941。
Garozzo，D.，Nasello，V.，Spina，E。和Sturiale，L。（1997）。异构寡糖的鉴别和未知物的测序，通过后源衰变基质辅助激光解吸/电离时间 - 飞行时质谱法。快速通讯质谱 11（14）：1561-1566。
Keegstra，K.和Cavalier，D。（2011）。 GT34和GT37家族的糖基转移酶。 In：Annual Plant Reviews ，第41卷.In：Ulvskov，P.，（ed）。植物多糖，生物合成。 Blackwell Publishing，pp。235-249。
Lombard，V.，Golaconda Ramulu，H.，Drula，E.，Coutinho，P.M.and Henrissat，B.（2014）。 2013年碳水化合物活性酶数据库（CAZy）。核酸 Res 42（数据库问题）：D490-495。
Mast，S.W.，Donaldson，L.，Torr，K.，Phillips，L.，Flint，H.，West，M.，Strabala，T.J.and Wagner，A。（2009）。探索辐射松中β（1,4） - 半乳聚糖的超微结构定位和生物合成压缩木材。植物生理学 150（2）：573-583。
Scheller，H.V。和Ulvskov，P。（2010）。半纤维素。 Annu Rev Plant Biol 61：263- 289.