材料和试剂

低分子量凝胶基小RNA分离
1. ssRNA标记（Takara Bio公司，目录号：3416）
2. 17％聚丙烯酰胺试剂，7M尿素PAGE
  1. 37.5：1聚丙烯酰胺：双丙烯酰胺（参见配方）
  2. 尿素（Life Technologies，目录号：15505-050）
  3. TEMED（Life Technologies，目录号：15524-010）
  4. 10％过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678-100G）（参见Recipes）
3. 2x RNA加载染料（参见配方）
基于DE81的核酸纯化
1. 玻璃纤维（康宁公司，目录号：988-10144）
2. 超厚污渍纸（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-3969）
3. Whatman DE81离子交换纤维素色谱纸（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-717-1A）
4. GlycoBlue共沉淀剂（Life Technologies，目录号：AM9516）
5. 100％乙醇
6. 75％乙醇
7. EB缓冲液（QIAGEN，目录号：19086）
8. 用于定量纯化的小RNA的Qubit RNA HS测定试剂盒（Life Technologies，目录号：Q32852）
9. 用于定量DNA扩增子的Qubit dsDNA HS测定试剂盒（Life Technologies，目录号：Q32854）
10. 低盐缓冲液（见配方）
11. 高盐缓冲液（见配方）
多重小RNA文库制备
1. 8-Strip PCR薄壁，200μl管（Corning Incorporated，Axygen ，目录号：PCR-0208-CP-C）
2. miRNA克隆接头1（/5'App/CTGTAGGCACCATCAAT/3'ddC /; 1nm）（Integrated DNA Technologies，目录号：11-04-03-05）
3. 截短的K227Q突变T4RNA连接酶2（New England Biolabs，目录号：M0351L）
4. 去腺苷酶（New England Biolabs，目录号：M0331S）
5. 外切核酸酶VII（United States Biological，目录号：70082Z）
6. RNA 5'衔接头（GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC）（Illumina RA5，目录号：15013205）
7. dATP（Life Technologies，目录号：55082）
8. T4 RNA连接酶I（Life Technologies，目录号：AM2141）
9. RT-PCR引物（ATTGATGGTGCCTACAG; 25nmol;脱盐）（Integrated DNA Technologies）
10. SuperScript III（Life Technologies，目录号：18080051）
11. Phusion高保真II（Thermo Fisher Scientific，目录号：F549L）
12. 5'PCR引物（Illumina小RNA PCR引物2：AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGA-GTTCTACAGTCCGA）
13. 3'标引的PCR引物I1-I12（100nmol; PAGE-纯化）（Integrated DNA Technologies）注意：下面的条形码（下划线序列）是反向互补的最后的Illumina输出序列（参见方括号中的序列每个引物）。
  I1 [CGATGT]：CAAGCAGAAGACGGCATACGA ACATCG ATTGATGGTGCCTACAG
  I2 [GATCAC]：CAAGCAGAAGACGGCATACGA GTGATCA TTGATGGTGCCTACAG
  I3 [CAGATG]：CAAGCAGAAGACGGCATACGA CATCTGA TTGATGGTGCCTACAG
  I4 [TACGTT]：CAAGCAGAAGACGGCATACGA AACGTAA TTGATGGTGCCTACAG
  I5 [TTACCA]：CAAGCAGAAGACGGCATACGA TGGTAAA TTGATGGTGCCTACAG
  I6 [ACTGTA]：CAAGCAGAAGACGGCATACGA TACAGT ATTGATGGTGCCTACAG
  I7 [ATCACG]： CAAGCAGAAGACGGCATACGA CGTGAT ATTGATGGTGCCTACAG
  I8 [ACTTGT]： CAAGCAGAAGACGGCATACGA ACAAGT ATTGATGGTGCCTACAG
  I9 [GCCAAT]： CAAGCAGAAGACGGCATACGA ATTGGCA TTGATGGTGCCTACAG
  I10 [TGCTAG]： CAAGCAGAAGACGGCATACGA CTAGCA ATTGATGGTGCCTACAG
  I11 [CTTGTA]： CAAGCAGAAGACGGCATACGA TACAAG ATTGATGGTGCCTACAG
  I12 [TCAGGC]： CAAGCAGAAGACGGCATACGA GCCTGA ATTGATGGTGCCTACAG
14. QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
15. 焦碳酸二乙酯（DEPC）-H 2 O/RNase-free H 2 O
16. DNA大小标记，适合检测〜120bp片段（50bp步骤梯，Promega公司，目录号：G4521; 25 bp步梯， Promega Corporation，目录号：G4511）
17. 3 M乙酸钠（NaOAc）（pH 5.5）
18. 6％天然PAGE的试剂
  1. 37.5：1聚丙烯酰胺：双丙烯酰胺（参见配方）
  2. TEMED（Life Technologies，目录号：15524-010）
  3. 10％过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678-100G）（参见Recipes）

设备

热循环仪
微量离心机：在室温和4℃下使用
Fisher凝胶负载尖端（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-707-182）
琼脂糖凝胶电泳系统（Bio-Rad Laboratories，Sub-Cell GT system）
聚丙烯酰胺凝胶电泳系统（Thermo Fisher Scientific，猫头鹰双凝胶垂直电泳系统）
65°C水浴
半干印迹系统（Sigma-Aldrich，半干印迹，目录号：Z340502）
加热块

程序

低分子量凝胶基小RNA分离
注意：

如果您已经纯化了小RNA（例如通过免疫沉淀），则不需要该步骤。请参阅Notes部分中的注释A. 在这种情况下，请跳到C部分。
此步骤的持续时间：
1. 凝胶制备和聚合：1+ h。
2. 凝胶预运行时间：30分钟以上。
3. 凝胶运行时间：4+ h，加载时间和染色。

制备含有7M尿素的0.5x TBE中的17％聚丙烯酰胺凝胶

在计划运行凝胶的前一天，组装玻璃板和盖子用Saran包装保护。
1. 使用14厘米x 16厘米和1.5毫米间隔板。
2. 清洁所有材料（板，垫片和梳子）。
  1. 用10％十二烷基硫酸钠（SDS）洗涤
  2. 用蒸馏水彻底冲洗。
  3. 用95％乙醇冲洗。
  4. 允许风干。
同时制备聚丙烯酰胺凝胶混合物（下图）：密封外边缘的板用2％琼脂糖（55℃）装配以防止泄漏。密封在几分钟内完成。

通过组合以下物质制备用于制备一个具有15孔梳的17％变性尿素-PAGE/0.5x TBE凝胶的混合物（30ml）：

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
丙烯酰胺：双37.5:1的溶液（30％）	17 ml（17％）
尿素	12.6g（7M）
TBE（10x）	1.5 ml（1x）	17 ml（17％）
尿素	12.6g（7M）
TBE（10x）	1.5 ml（1x）

Let stand on bench for ~10 min then transfer to an ice bath in the cold room (4 °C) for 15⁺ min.

Add the remaining reagents:

Reagent (stock concentration)	Volume (final concentration)
TEMED	25 µl *Mix thoroughly by inversion
APS (10%)	150 µl (0.05%) *Mix thoroughly by inversion

Pour the gel and allow it to polymerize for at least 30 min; should see beginning of polymerization within ~4 min.
装配您的电泳装置，并将运行缓冲液（0.5×TBE）加入室内和室外
用注射器冲洗孔; 冲洗掉玻璃板底部边缘的气泡
凝胶必须预运行（在180V）30-60分钟以除去所有痕量 APS（铵和过硫酸根离子），以分布/平衡任何添加到运行缓冲液中的稳定因子或离子，和以确保在样品运行期间恒定的凝胶温度。预跑时，带的凹形前端的出现减少凝胶。如果需要，可以加载空白溶液：混合等量 DEPC-H 2 O和2x负载染料。 15μl/泳道就足够了。

准备RNA样品并运行凝胶
*将样品体积保持在最小分辨率（≤50μl）。
1. 使用2x RNA加样染料以最终浓度1x制备样品，标记，梯子和空白等体积。
2. 将样品在65℃加热10分钟，立即在冰上淬灭。短暂旋转以收集试管底部的样品。
3. 加载样品。
  注意：在装载样品前，用注射器清洁通道以除去过量的尿素。样品加载决定了您的最终质量凝胶。我们使用费歇尔凝胶加载提示加载小RNA凝胶。加载样品在井的最底部在平带中，没有三角形， blob或其他草率加载。
4. 在0.5×TBE缓冲液中在180V下运行，直到溴酚蓝（BPB）染料到达凝胶底部（〜4至4.5小时）。
5. 在0.5×TBE缓冲液中用溴化乙锭染色凝胶
6. 参见下文，使用DE81纸从丙烯酰胺片段洗脱RNA

第二部分。基于DE81的核酸纯化
注意：此步骤的持续时间

切割凝胶切片和半干转移：40分钟以上。
洗脱（RNA）：60+分钟（第1天）; 沉淀1：过夜; 沉淀＃2：2.5+ h。
洗脱（DNA）：60+分钟（第1天）; 沉淀＃1：1+ h; 沉淀＃2：2+ h。

准备洗脱管
1. 从500微升离心管中取出盖子，戳一个孔底部中心用25号针（图1A）。标签管
2. 材料〜25-40毫克无菌玻璃棉在底部（不通过孔）使用无菌牙签或移液管尖端。将玻璃棉紧密地压在0.1毫升刻度标记的下面管离开DE81纸和缓冲器的空间（图1B）
3. 从2毫升微量离心管（图1C）取出盖，并放置准备的500微升管（图1D）内。
  
  图 1.洗脱管的制备。 A.500μl微量离心管已经去除了帽并且在底部中心制造了一个孔。 B.玻璃棉放置在管内并压实，为缓冲液留下空间和DE81纸。 C.取出2ml微量离心管。 D. 准备500微升管放置在2毫升管内，并准备使用。
核酸切除和转移
1. 放置一个厚的Whatman纸，用0.5x TBE预浸泡，半干吸墨纸用试管或10ml移液管滚动以除去任何气泡
2. 从凝胶中消除所需的片段（图2），并放置在一块 DE81纸用铅笔标记。每个样品/重复应该放在自己的DE81纸上。 DE81纸含有二乙基氨基乙基（DEAE）纤维素官能团，其将结合核酸，可以通过加入高盐缓冲液来逆转（Dretzen等人， 1981）。
  包括转移控制 - 即传输含有来自梯形泳道的条带的凝胶片段。
  
  图 2.用17％聚丙烯酰胺 - 尿素凝胶进行小RNA分离染色溴化乙锭。 A.小RNA切除前的总RNA。同样泳道，切除小RNA（18-26nt）。 ssRNA标记大小表示。
3. 将纸+凝胶放在浓厚的Whatman纸上的吸纸器。
4. 将第二块预浸泡的厚Whatman纸放在上面。
5. 小心地滚动第二张Whatman纸的顶部以除去任何气泡。
6. 在半干印迹中以400mAmp转移20分钟。
7. 取出顶部的Whatman纸。
  1. 通过检查凝胶片段和DE81纸的验证转移标记的转移控制，并排，在紫外透射仪上。核酸不应在凝胶片段中可见（图3A），但是应该在DE81纸上可见（图3B）。转移ssRNA 标记可能难以可视化
    
    图3.验证核酸转移。 A.概述了凝胶片段，没有核酸是可见的。 B.可见核酸转移的DE81纸（50bp DNA步梯）。
  2. 而凝胶+纸仍然在底部 Whatman纸，用剃刀剪掉多余的DE81纸。丢弃凝胶切片，并仔细填塞DE81纸进入洗脱管含玻璃棉。
核酸洗脱
1. 彻底淹没DE81纸〜200微升（通常200-500微升）的低盐缓冲液。使用移液管尖端轻轻推动纸尽可能低，所以它完全被缓冲区覆盖。
2. 在台式微量离心机中以最大速度旋转30秒。丢弃流通。
3. 重复低盐缓冲液洗涤两次，共三次洗涤。
4. 将上层柱/纸组件转移到一个清洁，标记的2毫升管，取下盖子
5. 洗脱：
  1. 向纸中加入150μl高盐缓冲液，并将其浸没
  2. 在70°C孵育15分钟 - 使用箔覆盖管。不要使用水浴。
  3. 在台式微量离心机中短暂（10秒）旋转，并保存流量。
6. 在过滤器组件下面放置一个新的2 ml管，并重复步骤C5（洗脱）两次
7. 乙醇沉淀：
  1. 合并三种洗脱液并加入20μg糖原（例如GlycoBlue）。
  2. 加入2.5体积100％乙醇并混合。理想的降水量装配在单个1.5ml微量离心管中。使用150μl的高盐缓冲液+〜1,150μl乙醇将适合于1.5ml微量离心机管=更有效的降水
  3. -80°C沉淀：RNA样品过夜; DNA样品为1 + h
  4. 在冷冻微量离心机中以最大速度离心：
    1. RNA样品为35分钟
    2. DNA样品15分钟。
  5. 倒出乙醇，用75％乙醇洗涤沉淀
  6. 在冷藏微量离心机中以最大速度旋转5分钟
  7. 在干净的KimWipe 10上倒掉乙醇和倒置管 min。如有必要，使用干净的KimWipe清除多余的液体管内 - 避免接触（蓝色）颗粒
  8. 重悬沉淀在40μlDEPC处理的水中（如果一个样品的多个沉淀，在此步骤中将池沉淀物最终体积为40μl）。
8. 需要第二次沉淀以除去用于下游酶促步骤的残余盐：
  1. 加入4μl3 M NaOAc。加入100μl100％乙醇。混合。在-80℃下沉淀至少2小时（或过夜）
    1. 按照步骤C7d-g。
    2. 将最终的沉淀重悬在10-12μlDEPC-H 2 O用于RNA或10-12μl用于DNA的EB缓冲液中。
9. 如果分离小RNA：RNA现在已经准备好作为模板多重小RNA文库制备步骤（下文C节）。
  1. 定量：2微升+ Qubit RNA HS测定试剂盒。对于样品 Qubit返回小RNA的值，使用推荐量（5-10μg）用于小RNA文库制备。对于样品也是低检测，我们建议使用整个样品（高达11.5μl）as 图书馆准备的输入。
10. 如果分离DNA：DNA现在可以进行定量并提交到测序设备。
  1. 定量：2μl+ Qubit dsRNA HS测定试剂盒

第三部分。复制小RNA文库制备
注意：

对于来自总RNA的小RNA：推荐5-10ng小RNA（即从50μg总RNA中分离）。
协议已经成功用于在一个流动池道中多路复用2,3,4,5,6,10或12个样品。
Illumina数据中适配器 - 适配器污染的典型水平为<1％。
此步骤的持续时间：
1. 步骤1是隔夜的步骤。
2. 步骤2-7可以在1天内进行，步骤8加第二天的DE81洗脱。
如果最终浓度不足以进行测序，则可以在-20℃保存RNA连接产物和cDNA产物，以用于产生另外的DNA扩增子。
混合和旋转是指短暂的离心，然后短暂离心

3'衔接子连接（不依赖ATP）

在无菌，无核酸酶的200μlPCR管中在冰上为每个样品使用以下设置连接反应：

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
3'适配器（10μM）	1.5μl（1.3μM）
RNA（可变）	变量（10 ng）
H sub 2 O	最终体积：11.5μl

混合和旋转样品。
将管在预热的热循环仪中在70℃下孵育2分钟，然后将管置于冰上。
注意：在70°C孵育后将混合物保持在冰上以防止二级结构形成是非常重要的。
将热循环仪预冷至16°C

在冰上制备以下主混合物（1x）：

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
连接缓冲液（10x）	1.5μl（1x）
RNaseOUT（40 U /μl）	1μl（40 U）
T4 RNA连接酶2，截短的K227Q（200U /μl）	1μl（200 U）

向每个管中加入3.5μl主混合物。混合和旋转。
将管在预冷却的热循环仪中在16℃下孵育过夜（15-18小时）。请参阅注释部分中的注释B.

3'适体去腺苷酸化
1. 向每个连接反应中，加入1μl去腺苷酶（20U /μl）。混合和旋转。
2. 在30℃下在热循环仪中孵育管15分钟。
3'衔接子消化
1. 向每个连接反应中，加入1μl外切核酸酶VII（10U /μl）。混合和旋转。
2. 孵育管在热循环仪在37℃15分钟。

5'衔接子连接（ATP依赖性）

等分所需的5'RNA适配器（1微升/反应）的量薄壁200μlPCR管，然后在70°C孵育2分钟和冷却在冰上

在该管中，使用以下（1x）在冰上制备主混合物：

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
5'RNA衔接子（15 pmol /μl）	1μl（15 pmol）
dATP（10mM）	1μl（0.48mM）
T4 RNA连接酶（5U /μl）	1μl（5 U）
H sub 2 O	1微升

加入4μl的主混合物到每个结扎管。混合和旋转。
在28℃孵育1小时，然后将管置于冰上。

cDNA合成

为每个样品标记一个新试管。将6μl连接产物转移到新试管中。

使用以下（1x）在冰上制备主混合物：

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
RT-PCR引物（100μM）	2.5μl（5μM）
dNTPs（10mM）	2.5μl（0.5mM）
H sub 2 O	18微升

添加23微升的主混合物到每个管。混合和旋转。
在热循环仪中将管热至65℃5分钟。在冰上冷却至少2分钟。

使用以下（1x）准备第二个主混音：

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
RT缓冲区（10x）	5μl（1x）
MgCl 2（25mM）	10μl（5 mM）
DTT（100mM）	5μl（10 mM）
RNaseOUT（40 U /μl）	1μl（40 U）

向每个样品（每个管中的最终体积：50μl）中加入21μl主混合物。混合和旋转。
在台面上孵育管2分钟，以允许引物-RNA杂交
加入1μlSuperScript III RT聚合酶（200 U /μl）到每个管。混合和旋转。转移到热循环仪：
一个。聚合反应：50℃下50分钟 b。灭活反应：在85℃下5分钟
将管冷却至4℃，短暂旋转它们，然后加入1μl的RNase H（2U）。充分混合并旋转。转移到热循环仪：
一个。 37℃20分钟
在冰上冷却样品。

线性PCR扩增

标记一套新的管。将25μlcDNA反应产物转移到新试管中

使用以下（1x）在冰上制备主混合物：

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
Phusion HF缓冲液（5x）	10μl（1x）
5'PCR引物（25μM）	0.5μl（0.25μM）
3'引物PCR引物（25μM）	0.5μl（0.25μM）
dNTP混合物（10mM）	0.5μl（0.1mM）
Phusion聚合酶（2U /μl）	0.5μl（1 U）
H sub 2 O	13微升

等分25μl主混合物到每个管。混合和旋转。
推荐的PCR条件：
1. 在98℃下30秒/
2. 高达17个循环：在98℃10秒; 60℃下30秒; 在72℃下15秒/
3. 72℃10分钟
4. 保持在4°C

验证凝胶
1. 倒入2％琼脂糖凝胶与20孔梳。混合5μlPCR产物+ 5μl 的加载染料（优选橙G或不会使a染色的染料）带〜100bp）。加载所有10微升在凝胶上，并在80-85 V运行〜20分钟。包括具有100bp条带（例如 50bp步进梯）的DNA梯状物。
2. 当琼脂糖凝胶运行时，使用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒清除PCR反应。
  1. 向PCR样品+缓冲液PB中加入5μl3M NaOAc（pH5.5）以调节pH
  2. 用30μlEB洗脱。
3. 可视化琼脂糖凝胶 - 所需的条带应刚好在100 bp以上（图4）。成功扩增子的预期大小= 112-120bp （5'适配子：49bp，3'适配子：45bp，小RNA：18-26bp）（图4A）。适配器 - 衔接头产物为94bp（图4B）
  
  图4.琼脂糖检查具有50bp步梯的凝胶。 A.扩增子带是所需的大小，高于100个碱基对。 B.样本带小于预期，由于过量的适配器 - 适配器产品。

纯化凝胶

通过组合以下：用15孔梳子制备6％天然PAGE/0.5x TBE凝胶;

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
丙烯酰胺：双37.5:1的溶液（30％）	6 ml（6％）
TBE（10x）	1.5 ml（0.5x）
H sub 2 O	22.2ml

通过倒置将上述混合在一起。

添加剩余试剂：

试剂（贮存浓度）	体积（最终浓度）
TEMED	33微升
APS（10％）	240μl（0.08％）*通过反转彻底混合

将凝胶倒入组装的玻璃板中，并使其聚合至少30分钟。

制备样品：以2（样品）：1（BPB）比（即，30μl样品加入15μl上样缓冲液）加入BPB染料。
1. 加载15μl/泳道（总共3泳道/样品）。
2. 这是为了防止过载一个通道，这导致拖尾。
使用1μl/泳道的25 bp步进梯或1μl/泳道的50 bp步进梯标记，最终体积为15μl。
在100V下运行凝胶，直到BPB跑出凝胶的底部边缘（〜2.5至3小时）
用SybrGold（35μl在100ml 0.5×TBE中）染色至少10分钟。小心地切除对应于DNA扩增子的条带（图5），避免任何适配器适配器带。每个使用不同的剃刀样品。使用DE81转移法清除DNA（见B部分）。什么时候多个泳道用于一个样品，将所有泳道转移到同一个样品上一块DE81纸

图5.DNA扩增子纯化凝胶。显示了所需的扩增子（高于100bp的标记）。不需要适配器 - 适配器产品也存在但处于降低的水平相比DNA扩增子

样品多路复用
1. 为了提交小RNA文库到测序中心作为多个样品，各个样品必须混合在一起。后使用Qubit dsDNA HS定量每个文库制备物测定试剂盒，计算近似的纳摩尔浓度（nM）每个样品。可以使用以下公式：
  
  图书馆现在可以以等量的纳摩尔量混合在一起。最终浓度混合样品将取决于具体要求测序中心。

笔记

在Carbonell等人（2012）中，从与拟南芥（Arabidopsis thaliana）ARGONAUTE1共免疫沉淀的总RNA和小RNA构建小RNA文库。对于共免疫沉淀的小RNA，通过凝胶电泳（步骤A）跳过小RNA的分离，并且将样品直接用于方法C中。
这个协议已被用于从真菌（未发表的结果）制备多路复用小RNA文库，应该适用于其他生物。我们建议将来自在其3'末端缺乏2'-O-甲基化的小RNA的生物体的样品的3'接头连接孵育时间减少至1-2小时（Munafó和Robb，2010）。
测序后，数据应以FASTQ格式提供。为了在下游应用中使用小RNA数据，原始FASTQ数据需要解复用（鉴定样品索引序列）和3' （miRNA克隆接头1的鉴定和去除）。我们提供了脚本LibParse.pl（ https://github.com/carringtonlablabs/srtools ）来处理小型RNA数据集使用此处描述的协议生成。 LibParse.pl输出FASTA格式的小RNA序列，每个独特序列的读数。 SRTOOLS存储库中的其他脚本旨在利用LibParse.pl输出。或者，来自FASTX工具包的实用程序fastx_clipper（ http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）可用于替代LibParse.pl，以FASTQ格式输出解复用和适配器修剪的小RNA，用于与下游应用程序更广泛的兼容性。
LibParse.pl示例：
LibParse.pl -f in.fastq -t fastq -o libparse.prefix -r 50 -a libparse.failed -l libparse.log -v -e CTGTAG -E CGATGT，GATCAC，CAGATG，TACGTT，TTACCA，ACTGTA，ATCACG， ACTTGT，GCCAAT，TGCTAG，CTTGTA，TCAGGC
fastx_clipper示例：
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATCGATGT -o out.I1.fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATGATCAC -o out.I2.fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATCAGATG -o out.I.3fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATTACGTT -o out.I4.fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATTTACCA -o out.I5.fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATACTGTA -o out.I6.fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATATCACG -o out.I7.fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATACTTGT -o out.I8.fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATGCCAAT -o out.I.9fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v -M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATTGCTAG -o out.I10.fastq
fastx_clipper -Q33 -l 18 -i in.fastq -c -v-M 23 -a CTGTAGGCACCATCAATCTTGTA -o out.I11.fastq
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食谱

37.5:1丙烯酰胺：双溶液用于7M-尿素，17％聚丙烯酰胺凝胶和6％天然PAGE/0.5x TBE凝胶。
300g丙烯酰胺和8g双丙烯酰胺溶解在300ml预热的去离子水中。一旦溶解，用温去离子水调节终体积至1L。用0.45μM瓶顶真空过滤器过滤灭菌; 用铝箔包裹并在4℃下储存
10％过硫酸铵（APS）
将10克过硫酸铵加到80毫升去离子水中搅拌溶解
将最终体积调整为100 ml
注射器过滤器成10毫升等分，存储在-20°C
2x RNA加载染料（50ml） 47.5ml 100％甲酰胺 125μl10％SDS
0.0125g溴酚蓝
50μl0.5M EDTA
2.3ml H 2 O 2 / 最终浓度：
甲酰胺：95％
SDS：0.025％
溴酚蓝：0.025％
EDTA：0.5mM
低盐缓冲液（50ml）
0.5ml 1M Tris-HCl（pH7.6）
1.0ml 5M NaCl
0.1ml 0.5M EDTA
加入48.4ml H 2 O 2 / 最终浓度：
Tris-HCl（pH7.6）：10mM NaCl：100mM
EDTA：1mM
高盐缓冲液（50ml）
0.5ml 1M Tris-HCl（pH7.6）
10ml 5M NaCl 0.1ml 0.5M EDTA
0.526克L-精氨酸加入39.4ml H 2 O 2 / 最终浓度：
Tris-HCl（pH7.6）：10mM NaCl：1MH 2 / EDTA：1mM
L-精氨酸：50mM

致谢

该协议的原始版本在Carbonell等人（2012）中描述。协议的更新版本在Carbonell等人（2014）中描述。这项工作是由国家科学基金会（MCB-0956526，MCB-1231726）和国立卫生研究院（AI043288）的拨款支持。

参考文献

Carbonell，A.，Fahlgren，N.，Garcia-Ruiz，H.，Gilbert，K.B.，Montgomery，T.A.，Nguyen，T.，Cuperus，J.T.and Carrington，使用切片缺陷突变体对三种拟南芥 ARGONAUTES的功能分析。 a> 植物细胞 24（9）：3613-3629
Carbonell，A.，Takeda，A.，Fahlgren，N.，Johnson，S.C.，Cuperus，J.T.and Carrington，J.C。（2014）。新一代人工微RNA和合成的反式作用小干扰RNA载体，用于有效的基因沉默拟南芥植物生理 165（1）：15-29。
Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.and Chambon，P。（1981）。从琼脂糖和丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的可靠方法 Anal Biochem 112（2）：295-298。
Munafo，D.B.and Robb，G.B。（2010）。优化用于从小RNA产生cDNA的代表性库的酶反应条件。 RNA 16（12）：2537-2552。